第2章--生物物理技术-波谱技术--1.doc

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1、第2章 波谱技术摘要: 光谱学作为生物物理学研究中相对成熟的研究手段，有着广泛的应用。本文对光谱学中的一些光谱技术及其应用做了简单介绍。关键词：光谱学，紫外可见光光谱，荧光光谱，红外光谱Abstract: As one of the important and mature biological physics research methods, Spectroscopy has an extensive application. This article raises a general introduction on some of the Optical Spectroscopy and

2、 its application. Key words: spectroscopy, Ultraviolet visible light spectrum, fluorescence spectroscopy, infrared spectroscopy目录1. 绪论12. 波谱技术具体介绍12.1 紫外可见光吸收光谱（UV-vis Spectroscopy）22.1.1 紫外可见光分光光度计22.1.2 紫外可见光光谱的应用22.2 荧光光谱（Fluorescence Spectroscopy）32.2.1 荧光光谱仪32.2.2 荧光光谱的应用32.3 荧光相关光谱（Fluorescenc

3、e Correlation Spectroscopy）42.3.2 荧光相关光谱的应用42.4 荧光互相关光谱（Fluorescence cross-correlation spectroscopy）52.5 拉曼光谱（Roman Spectroscopy）52.5.1 拉曼光谱的优点52.5.2 表面增强拉曼光谱52.5.2 拉曼光谱的其他应用62.6 红外光谱（Infrared spectroscopy）62.6.1 红外光谱仪62.6.2 红外光谱的应用62.7 近红外光谱（Near-Infrared spectroscopy）72.8 二维红外光谱（Two-Dimensional In

4、frared Correlation Spectroscopy）73结论81. 绪论光谱学是光学的一个分支学科，它主要研究各种物质的光谱的产生及其同物质之间的相互作用。光谱是电磁辐射按照波长的有序排列，根据实验条件的不同，各个辐射波长都具有各自的特征强度。光谱技术被人们广泛的应用于分子能级、电子组态、分子几何形状、化学键、物质检测等许多方面。2. 波谱技术具体介绍根据光谱技术的方法不同，一般把光谱学分为发射光谱学、吸收光谱学、散射光谱学三类。其中发射光谱学主要包括：原子发射光谱（AES）、原子荧光光谱（AFS）、X射线荧光光谱法（XFS）、分子荧光光谱法（MFS）等；吸收光谱学主要包括：紫外可

5、见光法（UV-Vis）、原子吸收光谱（AAS）、红外观光谱（IR）、核磁共振（NMR）等；散射光谱学主要是拉曼散射（Raman）。 下面将对主要的波谱技术逐一介绍。2.1 紫外可见光吸收光谱（UV-vis Spectroscopy）研究物质在紫外、可见光区的分子吸收光谱的分析方法称为紫外-可见分光光度法。紫外可见分光光度法是利用某些物质的分子吸收200 800 nm光谱区的辐射来进行分析测定的方法。这种分子吸收光谱产生于价电子和分子轨道上的电子在电子能级间的跃迁，广泛用于无机和有机物质的定性和定量测定。2.1.1 紫外可见光分光光度计 紫外可见光分光光度计主要分为5大部件，分别是光源、单色器、

6、样品室、检测室及显示设备。2.1.2 紫外可见光光谱的应用紫外可见光光谱可用于研究生物大分子。传统的生物学研究，利用含苯环的氨基酸（酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸）在紫外区的吸收峰来测定蛋白质的含量，主要有280nm法和280nm、260nm差法。同样，紫外可见光光谱还可应用于核酸研究，利用核酸在260nm的吸收峰可以测量核酸的量，而利用280nm和260nm的吸光度值，可以检测核酸的纯度。文献报导牛血清白蛋白(BSA)水溶液在276 nm 和193 nm 有两个吸收峰（薛萍，et al.2002）。前者主要是蛋白质中酪氨酸、色氨酸的光吸收,后者主要是由肽基团的吸收而产生的。由紫外吸光谱的性质知,1

7、93 nm 附近的吸收峰是肽链(螺旋和无规则卷曲构象的主要识别峰) ,而(折迭构象型的吸收峰) 应在波长198 nm附近。故可推测此BSA 溶液中没有(折迭构象或极少) 。紫外可见光光谱也可以应用于纳米粒子的研究。如纳米银具有独特的光谱特性一些研究者研究过纳米银粒子的表面增强拉曼光谱和共振散射光谱，为纳米银在相关领域中的应用奠定了基础（张万忠，et al.2009）。纳米银的共振吸收光谱发生在Uv-vis区域，它与形成粒子的数量和粒径大小有直接的关系，还取决于纳米银粒子与反应介质之间的相互作用。利用紫外可见光光谱，对于不同浓度的前体AgNO3 所得到的纳米银的产量进行研究，如图1所示。当AgN

8、O3浓度从005 mol/L增大到0.15 mol/L_1时，形成粒子的共振峰强度依次增大，表明增大微乳体系中前驱体的浓度，有助于获得更多的纳米银粒子。当AgNO3浓度较低时(0.05mol/L)，纳米银的共振吸收不明显，表明体系中银离子的还原不完全。AgNO3浓度增加至0.10mol/L，形成粒子产生规则的共振吸收峰，其峰形较宽(半峰宽较大)、吸收强度较大，表明形成了大量的纳米银粒子，并且形成粒子的粒径较小。当AgNO3浓度继续增加至0.15 mol/L，纳米银粒子的等离子共振峰的半峰宽减小、最大吸收峰发生红移，意味着形成粒子的平均尺寸增大。如果继续增大AgNO3 浓度，体系中产生的纳米银粒

9、子极易发生团聚，形成大尺寸的纳米银颗粒并很快从微乳体系中沉降出来。图1 紫外可见光光谱显示AgNO3浓度对纳米粒子的影响2.2 荧光光谱（Fluorescence Spectroscopy）荧光光谱是指在辐射能激发出的荧光辐射强度进行定量分析的发射光谱分析方法。物体经过较短波长的光照，把能量储存起来，然后缓慢放出较长波长的光，放出的这种光就叫荧光。如果把荧光的能量-波长关系图作出来，那么这个关系图就是荧光光谱（吉昂，et al.2008）。2.2.1 荧光光谱仪荧光光谱仪主要包括了光源（一般为UV-VIS光源）、激发单色器、样品室、发射波长单色器、检测器、输出控制设备6个部分组成。2.2.2

10、荧光光谱的应用荧光光谱可以用于研究生物大分子。如研究蛋白质构象，实验室常利用色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸能发射荧光，且其产生的强度为100：9：0.5。同时利用蛋白质的天然荧光可以检测蛋白质结构变化。在生物膜研究中，利用荧光探针标记可以探测膜电位的变化，如图2所示。对一个标记了荧光基团的细胞与另一个无标记的细胞靠近，测量荧光光谱。当2个细胞融合以后，由于细胞膜的流动性，荧光基团会均匀的分布在2个细胞表面，所得到的荧光光谱会有明显变化。图2 荧光光谱在生物膜研究中的应用荧光光谱不仅能够应用于研究生物大分子的构像，在光活检中也有很强的应用(李步洪,et al.2005)。光活检是指利用光学技术来诊断人

11、类的各种疾病，该技术旨在为临床组织病理学提供一种无损、实时、精确和客观的先进活检手段.。其中激光诱导荧光光谱及其成像技术，以其极高的光谱和时间分辨率、灵敏度、精确度以及无损、安全、快速等优点而成为了光活检中的一个重要研究领域。激光诱导荧光光谱包括组织体自体荧光（内源性）光谱、药物荧光光谱（外源性）以及利用5-氨基酮戊酸进行体内诱导原卟啉形成的内源性药物荧光光谱。2.3 荧光相关光谱（Fluorescence Correlation Spectroscopy）荧光相关光谱（Fluorescence correlation spectroscopy, FCS）技术是一种利用荧光强度随时间的涨落进行

12、分析检测的荧光光谱技术。荧光相关光谱技术具有极高的灵敏度，可测定微区内（10-15 L）荧光团由于布朗运动或化学反应而导致的荧光强度涨落，是一种重要的单分子检测技术(许潇,et al.2008)。图3显示由微区内荧光分子运动所造成的荧光涨落图像。图3 荧光相关光谱产生原理2.3.2 荧光相关光谱的应用荧光相关光谱的重要应用之一就是测定物质的扩散系数。通过在待测物上标记荧光分子，或是利用自身具有荧光的待测物进行荧光相关光谱的测定，即可得到待测物质在溶液中的扩散系数。有研究者使用恶唑黄二聚体（YOYO）嵌入双链DNA 以进行荧光标记。由于不同长度的双链DNA 在溶液中的扩散系数不同，因此嵌入的YO

13、YO 的扩散时间会表现出明显的差异，并导致荧光相关光谱产生显著差异(Shimizu M, et al.2005)。图4所示，所得到的荧光相关光谱图。图4 荧光相关光谱研究DNA扩散系数2.4 荧光互相关光谱（Fluorescence cross-correlation spectroscopy） 荧光相关光谱在测量时，如果样品些性质十分相似,分析将十分困难。例如当两组分的分子量差别小于8倍时,其扩散系数之差小于2倍,此时用自相关FCS很难将其区分开。 为了克服这些困难, Eigen等提出了荧光互相关光谱设想, Schwille等首先在实验中实现。荧光互相关光谱是利用两个或多个不同的荧光团标记，

14、并用不同波长的激光束激发，各自发射的荧光用独立的检测器检测，只有同时标记两种染料的分子才能被互相关(Schwille P, et al.1997)。该方法可消除检测器引入的噪音，并提高检测特异性。2.5 拉曼光谱（Roman Spectroscopy）拉曼光谱及拉曼散射的光谱。1928年C.V.拉曼实验发现，当光穿过透明介质被分子散射的光发生频率变化，这一现象称为拉曼散射。在透明介质的散射光谱中，频率与入射光频率0相同的成分称为瑞利散射；频率对称分布在0两侧的谱线或谱带01即为拉曼光谱(伍林,et al.2005)。靠近瑞利散射线两侧的谱线称为小拉曼光谱；远离瑞利线的两侧出现的谱线称为大拉曼光

15、谱。光照射到物质上发生弹性散射和非弹性散射. 弹性散射的散射光是与激发光波长相同的成分.非弹性散射的散射光有比激发光波长长的和短的成分, 统称为拉曼效应。2.5.1 拉曼光谱的优点第一，拉曼光谱对于样品制备没有特殊要求。对形状、大小要求低，不必粉碎、研磨，不必透明，可以在固态、液态、气态多相态下测量。第二，对于样品数量要求比较少。可以是毫克甚至微克的数量级，适于研究微量和痕量样品。第三，拉曼光谱采用光子探针，对样品是无损伤探测。适合对那些稀有或珍贵的样品进行分析。第四，可以直接测量水溶液样品，比较适合于生物样品的测试，甚至可以用拉曼光谱检测活体中的生物物质。2.5.2 表面增强拉曼光谱由于拉曼

16、散射所得到的射线能量较弱，信号不易检测，近年来，表面增强拉曼光谱技术逐渐成为研究的热点。吸附在粗糙化金属表面的化合物由于表面局域等离子激元被激发所引起的电磁增强(即物理增强)，以及粗糙表面上的原子簇及吸附其上的分子构成拉曼增强的活性 点(即化学增强)，这两者的作用使被测定物的拉曼散射产生极大的增强效应。其增强因子可达103107，已发现能产生SERS的金属有Ag，Au，Cu 和Pt等少数金属，以Ag的增强效应为最佳，最为常用。表面增强拉曼光谱研究Ag, Au纳米粒子如图5所示。可以看出不同含量的Ag, Au纳米粒子所得到的表面增强拉曼光谱有着显著的区别，表面增强拉曼光谱作为研究纳米粒子的重要的

17、表征手段（王梅, et al.2006）。图5 纳米Au，Ag粒子表面增强拉曼光谱研究2.5.2 拉曼光谱的其他应用激光拉曼光谱技术作为一种非侵人性的检测技术，可以提供丰富的分子结构特征和物质成分信息，通常被称为物质的分子指纹(molecular fingerprints)，其在肿瘤研究发面有着很好的应用(闫天秀,et al.2008)。据文献报道，拉曼光谱技术在皮肤癌、鼻咽癌、肺癌、胃癌、结肠癌、乳腺癌及前列腺癌诊断中的都有一定的进展，将有可能成为未来发展的趋势。2.6 红外光谱（Infrared spectroscopy）红外光谱（infrared spectra），以波长或波数为横坐标以

18、强度或其他随波长变化的性质为纵坐标所得到的反映红外射线与物质相互作用的谱图(吴汉福,et al.2006)。按红外射线的波长范围，可粗 略地分为近红外光谱（波段为0.82.5微米）、中红外光谱（2.525微米）和远红外光谱（251000微米）。2.6.1 红外光谱仪研究红外光谱的方法主要是吸收光谱法。使用的光谱有两种类型。一种是单通道或多通道测量的棱镜或光栅色散型光谱仪，另一种是利用双光束干涉原理并进行干涉图的傅里叶变换数学处理的非色散型的傅里叶变换红外光谱仪(FTIR)。2.6.2 红外光谱的应用红外光谱的应用大致可分为两个方面：一是分子结构的基础研究应用红外光谱测定分子的键长、键角来推断研

19、究分子的基本结构；二是化学组成的分析，根据光谱中吸收峰的位置和形状来推断未知分子的结构，依据吸收峰的强度来测定混合物中组成的含量。用红外光谱作样品分析时基本不需要处理且不破坏和消耗样品，自身又无环境污染。对磁性纳米粒子的红外光谱分析，研究偶联剂对磁性纳米粒子的作用(王德平, et al.2005)。图6显示在无偶联剂作用时，磁性纳米粒子的红外光谱吸收图。，在588nm处有一铁的特征吸收峰。图6 未经偶联剂修饰的纳米粒子红外光谱图接下来，他们有Z-6020等硅烷偶联剂对得到的磁性纳米粒子进行修饰，得到了Z-6020硅烷偶联剂和利用偶联剂修饰的磁性纳米粒子的光谱图，如图7所示。分析可知在Z-602

20、0的光谱吸收曲线中1638cm-1处为-NH2特征吸收峰，1554cm-1为R2NH特征峰 ；这些与磁性纳米粒子中1718 cm-1的-NH2和1408 cm-1的R2NH的峰相对应。，并相应地，-NH2特征峰发生了蓝移，R2NH特征峰发生了红移。图7 Z-6020偶联剂和用Z-6020修饰的磁性纳米粒子的红外光谱图在医学方面，田惠军等用FTIR法对天然牛黄中胆红素钙的含量进行了定量测定。宋占军等采用FTIR法对蜂王浆中的王浆酸进行了定性及定量测定，他们都得到满意的结果(李英华, et al.2008)。2.7 近红外光谱（Near-Infrared spectroscopy）近红外光（Nea

21、r Infrared，NIR）是介于可见光（VIS）和中红外光（MIR）之间的电磁波，按ASTM（美国试验和材料检测协会）定义是指波长在7802526nm范围内的电磁波，习惯上又将近红外区划分为近红外短波（7801100nm）和近红外长波（11002526nm）两个区域。 近红外光谱属于分子振动光谱的倍频和主频吸收光谱，主要是由于分子振动的非谐振性使分子振动从基态向高能级跃迁时产生的，具有较强的穿透能力。近红外光主要是对含氢基团（、）振动的倍频和合频吸收，其中包含了大多数类型有机化合物的组成和分子结构的信息(张录达, et al.1990)。 近红外光谱在物质鉴定方面有着较多的应用，韩东海等报

22、道了利用近红外光谱技术检测生鲜乳中掺杂还原乳的方法(韩东海, et al.2007)。2.8 二维红外光谱（Two-Dimensional Infrared Correlation Spectroscopy） 二维红外光谱(two-dimensional infrared spectroscopy)，是分子体系对一系列超快红外激光脉冲所作出的一种时域非线性响应（受激振动光子回波）在频域中的双频率轴表达。它能提供关于 体系的分子振动耦合及振动动力学、以及振动驰豫过程等信息，反映的是在飞秒至皮秒时间轴上的分子结构动态信息。3结论 光谱技术不仅在物质鉴定、细胞分子结构的测定上有着其独特的优势，也被越

23、来越多的应用于物体表征学，比较分析中，其必将在生物物理研究中发挥着重要的作用。参考文献:1. 薛萍,郑文杰. 紫外可见光谱在生物无机化学中的应用. 广州化工,2002,30(4):79-822. 张万忠,乔学亮,罗浪里,陈建国 AOT微乳体系中纳米银的可控合成及紫外-可见光谱研究. 光谱学与光谱分析 2009，29（3）：789-7923. 吉昂,李国会,张华. 高能偏振能量色散X射线荧光光谱仪应用现状和进展. 岩矿测试, 2008,27(6):451-4624. 李步洪,谢数森. 荧光光谱及其成像技术在光活检中的应用. 光谱学与光谱分析, 2005, 7, 25(7): 10835. 许潇,

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