生化药物制备第二章基因工程制药.ppt
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1、第二章、基因工程制药第二章、基因工程制药第一节、概述第一节、概述 现代生物技术是一项与医药产业相互结合极为密切的高技术。1982年,第一个基因重组产品人胰岛素在美国问世。基因工程药物主要是医用活性蛋白和多肽类:基因工程药物主要是医用活性蛋白和多肽类:免疫蛋白、细胞因子、激素、酶类等免疫蛋白、细胞因子、激素、酶类等 优点优点:大量生产、应用临床、大量生产、应用临床、深入研究、扩大应用、改造不足深入研究、扩大应用、改造不足 。基因工程技术生产药品的优点:基因工程技术生产药品的优点:a.a.可大量生产过去难以获得的生理活性多肽和蛋可大量生产过去难以获得的生理活性多肽和蛋白质,为临床使用提供有效的保障
2、;白质,为临床使用提供有效的保障;b.b.可以提供足够数量的生理活性物质,以便对其生可以提供足够数量的生理活性物质,以便对其生理生化和结构进行深入的研究,从而扩大这些物质理生化和结构进行深入的研究,从而扩大这些物质的应用范围;的应用范围;c.c.利用基因工程技术可以发现、挖掘更多的内源利用基因工程技术可以发现、挖掘更多的内源 性生理活性物质;性生理活性物质;d.d.内源性生理活性物质在作为药物使用时存在的不足内源性生理活性物质在作为药物使用时存在的不足之处,可以通过基因工程和蛋白质工程进行改造;之处,可以通过基因工程和蛋白质工程进行改造;e.e.利用基因工程技术可获得新型化合物,扩大药物筛利用
3、基因工程技术可获得新型化合物,扩大药物筛选来源。选来源。第二节、基因工程药物生产的过程第二节、基因工程药物生产的过程基因工程技术基因工程技术:将所要重组对象的目的基因插入载体、拼接、转入新的宿主细胞,构建成工程细菌(或细胞),实现遗传物质的重新组合,并使目的基因在工程菌内进行复制和表达。噬菌体遗传学噬菌体遗传学限制酶的发现限制酶的发现质粒载体质粒载体细菌抗药性遗传学细菌抗药性遗传学噬菌体载体噬菌体载体DNA合成与修复合成与修复细菌基因细菌基因调节研究调节研究外源外源DNA插入载体插入载体动物病毒学动物病毒学细菌表达载体细菌表达载体构建基因文库构建基因文库哺乳动物表哺乳动物表达载体达载体大规模的
4、蛋白合成大规模的蛋白合成克隆特定克隆特定的基因的基因制备探制备探针针反转录病毒反转录病毒和反转录酶和反转录酶mRNA结构与结构与代谢的研究代谢的研究 寡核苷酸合成寡核苷酸合成蛋白序列分析蛋白序列分析小鼠胚胎学小鼠胚胎学插入生殖细胞插入生殖细胞定点突变改定点突变改变基因结构变基因结构功能分析功能分析序列分析序列分析 DNA序序列分析列分析RNA序序列分析列分析基因工程的诞生与及其相关学科的关系基因工程药物制药的主要程序目的基因的克隆,目的基因的克隆,构建构建DNADNA重组体,重组体,DNADNA重组体转入宿主菌,重组体转入宿主菌,构建工程菌,构建工程菌,工程菌发酵,工程菌发酵,表达产物的分离纯
5、化,表达产物的分离纯化,产品的检验等。产品的检验等。基因工程药物的制备流程 基因工程药物生产的基本过程基因工程药物生产的基本过程 基因工程药物的生产分为基因工程药物的生产分为上游上游和和下游下游两两个阶段个阶段 上游阶段上游阶段:主要是分离主要是分离目的基因目的基因、构建、构建工程菌工程菌(细胞细胞)。下游阶段下游阶段:从工程菌的大量培养一直从工程菌的大量培养一直到产品的分离纯化和质量控制到产品的分离纯化和质量控制。基因工程药物的上游技术:基因工程药物的上游技术:1 1、基因克隆载体、基因克隆载体:质粒载体,质粒载体,2 2、重组、重组DNADNA技术的有关工具酶及其应用技术的有关工具酶及其应
6、用 3 3、核酸制备技术:制备纯净、高质量的、核酸制备技术:制备纯净、高质量的 载体载体DNADNA和和待克隆的待克隆的 核酸,才能有效地进行后续的酶切、反转录、核酸,才能有效地进行后续的酶切、反转录、连接等分子克隆操作。连接等分子克隆操作。三、目的基因的获得三、目的基因的获得问题:来源于真核细胞的产生基因工程药物问题:来源于真核细胞的产生基因工程药物的目的基因,为什么不能进行直接分离?的目的基因,为什么不能进行直接分离?目的基因的获取途径:目的基因的获取途径:1 1、逆转录法、逆转录法 逆转录法就是分离纯化目的基因的逆转录法就是分离纯化目的基因的mRNAmRNA,再,再反转录成反转录成cDN
7、AcDNA,然后进行,然后进行cDNAcDNA 克隆表达。克隆表达。(1 1)、)、mRNA purificationmRNA purification(mRNAmRNA 纯化)纯化)a.a.细胞内细胞内RNARNA的组成和含量的组成和含量:DNA:95%DNA:95%核内,核内,5 5细胞器细胞器 RNARNA:7575细胞质,细胞质,10%10%核内,核内,15%15%细胞器细胞器 rRNA80-85%;tRNA10-15%;rRNA80-85%;tRNA10-15%;mRNA1-5%mRNA1-5%b.b.真核细胞真核细胞mRNA mRNA 的特点及分离纯化方法。的特点及分离纯化方法。3
8、 3-polyA-polyA(20-250AAA20-250AAA)-oligo(dToligo(dT)TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT AAAAA AAAAAOligo(dT)纤维素纤维素Poly(A)-Oligo(dT)100mM NaCl洗脱rRNA/tRNA10mM Tris1mM EDTAPoly(A)mRNATotal RNA纤维素柱纯化纤维素柱纯化Poly(A)mRNAPoly(A)mRNA 流程图流程图(2 2)、)、cDNAcDNA第一链的合成:一次好的逆转第一链的合成:一次好的逆转录反应可使录反应可使oligo(dToligo(dT)选出的选出的mRNAmR
9、NA有有5 530%30%被被拷贝。拷贝。(3 3)、)、cDNAcDNA第二链的合成;第二链的合成;反应在反应在DNADNA聚合酶聚合酶I I催化下完成催化下完成(4)、cDNA cloning;质粒DNA:expression vector pUC ,pBR322噬菌体DNA:gt11,gt11等。基因工程基本过程:基因工程基本过程:双重旋转对称的结构双重旋转对称的结构或称回文序列或称回文序列(palindrome)(palindrome)。(5)(5)、将重组体导入、将重组体导入host cellhost cell(6)(6)、cDNAcDNA library identificatio
10、n library identification(cDNAcDNA 文库的鉴定)文库的鉴定)(7)(7)、目的、目的cDNAcDNA 克隆的分离和鉴定(限制酶图谱的绘克隆的分离和鉴定(限制酶图谱的绘制、杂交分析、基因定位、基因测序、确定基因的制、杂交分析、基因定位、基因测序、确定基因的 转录方向、转录起始点等。)转录方向、转录起始点等。)2 2、反转录、反转录聚合酶链反应法聚合酶链反应法mRNAmRNA经反转录合成经反转录合成cDNAcDNA第一链,不需要再第一链,不需要再合成合成cDNAcDNA链,用于重组、克隆。链,用于重组、克隆。3 3、化学合成法、化学合成法 较小的蛋白质和多肽的编码基
11、因可以用较小的蛋白质和多肽的编码基因可以用人工化学合成法获得。人工化学合成法获得。化学合成法有个先化学合成法有个先决条件是:决条件是:必须知道目的基因的核苷酸排必须知道目的基因的核苷酸排列顺序,或知道目的蛋白质的氨基酸顺序,列顺序,或知道目的蛋白质的氨基酸顺序,再按相应的密码子推导出再按相应的密码子推导出DNADNA的碱基系列。的碱基系列。方法方法:合成目的基因:合成目的基因DNADNA不同部位的不同部位的两条链的寡核苷酸短片段,再退火成为两两条链的寡核苷酸短片段,再退火成为两端形成粘性末端的端形成粘性末端的DNADNA双链片段,然后将双链片段,然后将这些双链片段按正确的次序进行退火连接这些双
12、链片段按正确的次序进行退火连接成较长的成较长的DNADNA片段,再用连接酶连接成完片段,再用连接酶连接成完整的基因。整的基因。人工化学合成基因的限制人工化学合成基因的限制:a.a.不能合成太长的基因。最长不能合成太长的基因。最长50-60bp.50-60bp.只只适用于克隆小分子肽的基因。适用于克隆小分子肽的基因。b.b.人工合成基因时,遗传密码的简并会为人工合成基因时,遗传密码的简并会为选择密码子带来很大困难,选择密码子带来很大困难,如用氨基酸顺如用氨基酸顺序推测核苷酸序列,得到的结果可能与天序推测核苷酸序列,得到的结果可能与天然基因不完然基因不完 全一致,易造成中性突变。全一致,易造成中性
13、突变。c.c.费用太高。费用太高。筛选基因的其他方法筛选基因的其他方法1 1 编码序列富集法编码序列富集法2 2 岛屿获救岛屿获救PCRPCR法法*CpGCpG岛岛 CpGCpG岛(岛(CpGCpG islandsislands)是指)是指DNADNA上一个区域,上一个区域,此区域含有大量相联的胞嘧啶(此区域含有大量相联的胞嘧啶(C C)、)、鸟鸟嘌呤嘌呤(G G),以及使两者相连的磷酸酯键(),以及使两者相连的磷酸酯键(p p)。哺乳)。哺乳类基因中的类基因中的启启动子上,含有约动子上,含有约40%40%的的CpGCpG岛(人类岛(人类约约70%70%)。一般)。一般CpGCpG岛的长度约岛
14、的长度约300300到到30003000个碱基对个碱基对(bpbp)。)。常用的正式定义是指一个至少含有常用的正式定义是指一个至少含有200bp200bp的区域,的区域,其中其中GCGC所佔比例超过所佔比例超过50%50%,且,且CpGCpG的观察值预的观察值预测值比例必须高於测值比例必须高於0.60.6。*持家基因持家基因(house-keeping gene)(house-keeping gene)*AluAlu序列序列 AluAlu重复序列是哺乳动物基因组中重复序列是哺乳动物基因组中SINESINE家族的家族的一员,约有一员,约有5050万份拷贝。也就是说平均万份拷贝。也就是说平均4 4
15、6 kb6 kb中中就有一个就有一个AluAlu序列。由于这种序列。由于这种DNADNA序列中有限制性序列中有限制性内切核酸酶内切核酸酶AluAlu工的识别序列工的识别序列AGCTAGCT,所以称为,所以称为AluAlu重复序列。重复序列。3 3 动物杂交法动物杂交法4 4 功能克隆法功能克隆法依赖于基因表达产物和生物学功能的基因克隆法。依赖于基因表达产物和生物学功能的基因克隆法。5 5 构建构建cDNAcDNA文库文库6 6 差异显示技术差异显示技术第四节、第四节、基因表达 基因表达基因表达是指结构基因在生物体中的转录、翻译以及所有加工过程转录、翻译以及所有加工过程。基因高效表达基因高效表达
16、是指外源基因在某种细胞中的表达活动,即剪切下一个外源基因剪切下一个外源基因片段,拼接到另一个基因表达体系中,使片段,拼接到另一个基因表达体系中,使其能获得既有原生物活性又可高产的表达其能获得既有原生物活性又可高产的表达产物。产物。进行基因表达研究的主要问题进行基因表达研究的主要问题是目的是目的基因的表达产量、表达产物的稳定性、基因的表达产量、表达产物的稳定性、产物的生物学活性和表达产物的分离产物的生物学活性和表达产物的分离纯化。纯化。因此,建立最佳的基因表达体因此,建立最佳的基因表达体系,是基因表达设计的关键。系,是基因表达设计的关键。1 1、宿主细胞的选择 (1 1)、宿主细胞的基本要求)、
17、宿主细胞的基本要求:容易获得较高浓度的细胞;容易获得较高浓度的细胞;能利用易得廉价原料;能利用易得廉价原料;不致病、不产生内毒素;不致病、不产生内毒素;发热量低,需氧低,适当的发热量低,需氧低,适当的发酵温度和细胞形态;发酵温度和细胞形态;容易进行代谢调控;容易进行代谢调控;容易进行容易进行DNADNA技术操作;技术操作;产物的产量、产率高,产物的产量、产率高,且易提取纯化。且易提取纯化。宿主细胞的宿主细胞的 分类分类 原核细胞,常用的有大肠杆菌、枯草芽孢原核细胞,常用的有大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、链霉菌等;杆菌、链霉菌等;真核细胞,常用的有酵母、丝状真菌、哺真核细胞,常用的有酵母、丝状真菌、哺
18、乳动物细胞。乳动物细胞。(1)(1)、原核细胞、原核细胞 a:a:大肠杆菌:表达产物的形式大肠杆菌:表达产物的形式,细胞内不溶细胞内不溶性表达(包含体)、胞内可溶性表达、细性表达(包含体)、胞内可溶性表达、细胞周质表达,极少还可分泌到胞外表达。胞周质表达,极少还可分泌到胞外表达。不同的表达形式具有不同的表达水平,且不同的表达形式具有不同的表达水平,且会带来完全不同的杂质。会带来完全不同的杂质。、大肠杆菌中的表达不存在信号、大肠杆菌中的表达不存在信号肽,故产品多为胞内产物,提肽,故产品多为胞内产物,提 取时需取时需破碎细胞,此时细胞质内其他蛋白也破碎细胞,此时细胞质内其他蛋白也释放出来,因而造成
19、提取困难。释放出来,因而造成提取困难。、由于分泌能力不足,真核蛋白、由于分泌能力不足,真核蛋白质常形成不溶性的包含体质常形成不溶性的包含体(inclusion(inclusion body)body),表达产物必须在下游处理过程,表达产物必须在下游处理过程中经过变性和复性处理才能恢复其生中经过变性和复性处理才能恢复其生物活性。物活性。包涵体是指细菌表达的蛋白在细胞包涵体是指细菌表达的蛋白在细胞 内凝集,形成无活性的固体颗粒。内凝集,形成无活性的固体颗粒。特点特点:、在大肠杆菌中表达在大肠杆菌中表达不存在翻译后修饰不存在翻译后修饰作用作用,故对蛋白质产物不能糖基化,因此,故对蛋白质产物不能糖基化
20、,因此,只适于表达不经糖基化等翻译后修饰仍具只适于表达不经糖基化等翻译后修饰仍具有生物功能的真核蛋白质,在应用上受到有生物功能的真核蛋白质,在应用上受到一定的限制。一定的限制。由于翻译常从甲硫氨酸的由于翻译常从甲硫氨酸的AUGAUG密码子密码子开始,故目的蛋白质的开始,故目的蛋白质的N N端常多余一个端常多余一个甲硫甲硫氨酸残基氨酸残基,容易引起免疫反应。大肠杆菌,容易引起免疫反应。大肠杆菌会产生很难除去的内毒素,还会产生蛋白会产生很难除去的内毒素,还会产生蛋白酶而破坏目的蛋白质。酶而破坏目的蛋白质。b:b:枯草芽孢杆菌:分泌能力强,可将蛋白质产枯草芽孢杆菌:分泌能力强,可将蛋白质产物直接分泌
21、到培养液中,不形成包含体。该物直接分泌到培养液中,不形成包含体。该菌也不能使蛋白质糖基化,另外由于它有很菌也不能使蛋白质糖基化,另外由于它有很强的胞外蛋白酶,会对产物进行不同程度的强的胞外蛋白酶,会对产物进行不同程度的降解,因此,它的应用也受到限制。降解,因此,它的应用也受到限制。C:C:链霉菌链霉菌:重要的工业微生物。特点是重要的工业微生物。特点是不致病、使用安全,分泌能力强,可不致病、使用安全,分泌能力强,可将表达产物直接分泌到培养液中,具将表达产物直接分泌到培养液中,具有糖基化能力,可做理想的受体菌。有糖基化能力,可做理想的受体菌。(2)真核细胞a:酵母酵母:繁殖迅速,可廉价的大规模培养
22、,繁殖迅速,可廉价的大规模培养,而且没有毒性,基因工程操作与原核生物而且没有毒性,基因工程操作与原核生物相似,表达产物直接分泌到细胞外,简化相似,表达产物直接分泌到细胞外,简化了分离纯化工艺。表达产物能糖基化。特了分离纯化工艺。表达产物能糖基化。特别是某些在细菌系统中表达不良的真核基别是某些在细菌系统中表达不良的真核基因,在酵母中表达良好。目前以酿酒酵母因,在酵母中表达良好。目前以酿酒酵母应用最多。干扰素和乙肝表面抗原已获成应用最多。干扰素和乙肝表面抗原已获成功。功。b:b:丝状真菌:很强的分泌能力;能正确进行翻丝状真菌:很强的分泌能力;能正确进行翻译后加工,包括肽剪切和糖基化;而且糖译后加工
23、,包括肽剪切和糖基化;而且糖基化方式与高等真核生物相似;基化方式与高等真核生物相似;丝状真菌丝状真菌(如曲霉)被确认是安全菌珠,有成熟的(如曲霉)被确认是安全菌珠,有成熟的发酵和后处理工艺。发酵和后处理工艺。*哺乳动物细胞哺乳动物细胞 由于外源基因的表达产物可由重组转化的细胞由于外源基因的表达产物可由重组转化的细胞分泌到培养液中,培养液成分完全由人控制,从而分泌到培养液中,培养液成分完全由人控制,从而是产物纯化变得容易。产物是糖基化的,接近或是产物纯化变得容易。产物是糖基化的,接近或 类似于天然产物。类似于天然产物。但动物细胞生产慢,生产率低,但动物细胞生产慢,生产率低,而且培养条件苛刻,费用
24、高,培养液浓度较稀。而且培养条件苛刻,费用高,培养液浓度较稀。虽然从理论上讲,各种微生物都可以用于基因虽然从理论上讲,各种微生物都可以用于基因表达,但由于克隆载体、表达,但由于克隆载体、DNADNA导入方法以及遗传导入方法以及遗传背景等方面的限制,目前使用最广泛的宿主菌仍然背景等方面的限制,目前使用最广泛的宿主菌仍然是大肠杆菌和酿酒酵母。是大肠杆菌和酿酒酵母。2 2、大肠杆菌体系中的基因表达、大肠杆菌体系中的基因表达(1 1)表达载体)表达载体真核基因在原核细胞中表达载体必须具备条件:真核基因在原核细胞中表达载体必须具备条件:载体能够独立复制。载体本身是一个复制子,载体能够独立复制。载体本身是
25、一个复制子,具有复制起点。具有复制起点。严谨型:严谨型:1-31-3个拷贝个拷贝 松弛型:可达松弛型:可达30003000个个应具有灵活的克隆位点和方便的筛选标记,以应具有灵活的克隆位点和方便的筛选标记,以利于外源基因的克隆鉴定和筛选。利于外源基因的克隆鉴定和筛选。应具有很强的启动子,能为大肠杆菌应具有很强的启动子,能为大肠杆菌RNARNA聚合聚合酶所识别。酶所识别。应具有阻遏子,使启动子受到控制,只有当诱应具有阻遏子,使启动子受到控制,只有当诱导时才能进行转录。导时才能进行转录。应具有很强的终止子,只转录克隆的基因,所应具有很强的终止子,只转录克隆的基因,所产生的产生的mRNAmRNA较为稳
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- 生化 药物 制备 第二 基因工程 制药