第1章---生物物理技术-显微技术--1.doc

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1、第1章 显微技术摘要：显微技术是当今研究微观世界最主要的手段，将人眼无法识别的物体直观、人眼可辨别得展现出来，对于微观物质的认识具有重要的作用，显微镜是显微技术中的硬件支撑。本文将介绍显微技术的历史、发展以及光学显微镜的原理、构造和应用，包括普通复式光学显微镜、荧光显微镜技术、激光共聚焦荧光显微镜技术、全内反射荧光显微镜技术。关键词：显微技术、普通复式显微镜、荧光显微镜、激光共聚焦显微镜、全内反射荧光显微镜。目录摘要11 显微技术31.1显微技术概念31.2 显微技术的发展历史31.2.1 显微镜的发展历史31.2.2显微样品制备技术的产生和发展31.2.3 观察结果的记录、分析和处理41.2

2、.4 显微技术的应用41.3 微观到宏观的尺度51.3.1 物质世界的尺度51.3.2 人眼及显微镜的分辨极限52. 普通光学复式显微镜62.1普通光学复式显微镜的工作原理62.1.1 显微镜的光学原理62.1.2 显微镜的成像原理72.2 显微镜的几个基本概念82.2.1 光源82.2.2 数值孔径82.2.3 分辨率82.2.4 放大倍数82.2.5 实际视野82.3光学显微镜的分类82.4 显微镜的构造102.4.1 光学显微镜的机械部分102.4.2 光学系统部分122.5 光学显微镜的使用方法122.5.1 显微镜使用操作132.5.3油镜的使用方法132.5.4使用显微镜应注意的事

3、项142.6 显微镜的保养与维护143. 荧光显微技术153.1 荧光技术分类153.1.1自发荧光153.1.2 二次荧光153.1.3抗体荧光技术153.2 荧光产生原理153.2.1 分子能级与跃迁163.2.2 荧光的产生163.3荧光参数173.3.1激发光谱173.3.2发射光谱173.4 常见的荧光物质，激发及发射波长183.4.1 荧光色素183.4.2 荧光蛋白183.5 荧光显微镜183.5.1 荧光显微镜原理183.5.2 荧光显微镜分类203.5.3 荧光显微镜的构造213.6荧光显微镜的使用与注意事项223.6.1使用方法：223.6.2荧光图像的记录方法：233.6

4、.3 注意事项：234. 激光共聚焦显微镜234.1 激光共聚焦显微镜与传统显微镜234.1.1 传统显微镜的缺陷234.1.2 激光共聚焦显微镜的优势244.2 激光共聚焦显微镜的原理244.3 激光共聚焦显微镜的构造254.4激光共聚焦显微镜的应用264.4.1 细胞、组织的三维观察和定量测量264.4.2活细胞生理信号的动态监测264.4.3粘附细胞的分选264.4.4细胞激光显微外科和光陷阱功能274.4.6在细胞凋亡研究中的应用274.4.7在肿瘤研究中的应用274.4.8细胞内离子分析274.4.9图像分析与三维重建274.4.10细胞形态学研究275. 全内反射荧光显微镜275.

5、1 全内反射荧光显微镜的原理275.1.1全内反射原理285.1.2 消逝波285.2 全内反射荧光显微镜285.2.1 棱镜型全内反射荧光显微镜295.2.2 物镜型全内反射荧光显微镜295.2.3 两种显微镜的比较295.3 全内反射荧光显微镜的优点305.4 全内反射荧光显微镜在生物学上的应用305.4.1分子马达的运动305.4.2 蛋白分子相互作用305.4.3 生物大分子动态构像变化观察305.4.4 离子通道研究30参考文献301 显微技术1.1显微技术概念 显微技术（microscopy）是利用光学系统或电子光学系统设备，观察肉眼所不能分辨的微小物体形态结构及其特性的技术，包括

6、：各种显微镜的基本原理、操作和应用的技术；显微镜样品的制备技术；观察结果的记录、分析和处理的技术。其中部分属于显微技术的理论部分，属于显微部分的硬件环节，属于数据处理的范畴。1.2 显微技术的发展历史1.2.1 显微镜的发展历史原始的光学显微镜是一个高倍率的放大镜。据记载，在1610年前意大利物理学家伽利略已制作过复式显微镜观察昆虫的复眼。这是一种已具目镜、物镜和镜筒等装置，并固定在支架上的显微镜。第一架复式显微镜是由荷兰的一位眼镜制造商-沙加里亚斯杨森于1590年发明的。实际上，这台显微镜是从放大镜逐步发展而成的，它由一个双面凸透镜和一个双面凹透镜组合而成，长为40cm，镜筒直径为5cm（陈

7、琳，2006）。荷兰人 Ava列文虎克一生制作了不少于247架显微镜，观察了许多细菌、原生动物和动、植物组织，是第一个用显微镜作科学观察的人。到18世纪显微镜已有许多改进，应用比较普遍，已作为一种商品进行生产。18721873年，德国物理学家和数学家E阿贝提出了光学显微镜的完善理论，从此，镜头的制作可按预先的科学计算进行。同时，德国化学家肖特成功地研制出供制作透镜的光学玻璃。他们和德国显微镜制作家-卡尔蔡司合作，建立了蔡司光学仪器厂，于1886年生产出具复消色差油镜的现代光学显微镜，达到了光学显微镜的分辨限度。从19世纪后期至20世纪60年代发展了许多类型的光学显微镜，如：偏光显微镜、暗视场显

8、微镜、相差显微镜、干涉差显微镜、荧光显微镜。此外，还有许多特殊装置的显微镜，例如在细胞培养中特别有用的倒置显微镜。20世纪80年代后期又发展了一种同焦扫描激光显微镜，结合图象处理，可以直接观察活细胞的立体图，是光学显微镜的一大进展。1934年由M诺尔和E鲁斯卡在柏林制造成功第一台实用的透射电子显微镜。其成象原理和光学显微镜相似，不同的是它用电子束作为照射源，用电子透镜代替玻璃透镜，整个系统在高真空中工作。由于电子波长很短，所以分辨率大大提高。在电镜制作的实验阶段就曾尝试观察生物材料。1934年布鲁塞尔大学的L马顿在美国就发表过用锇酸固定的茅膏菜植物叶子切面的电镜图。1949年A克劳德、KR波特

9、和E皮克尔斯获得了第一张细胞超显微结构的电镜图。到20世纪50年代，透射电子显微镜在生物学的研究中已被广泛的应用。分辨率已由最初的500埃提高到小于2埃。20世纪50年代扫描电子显微镜在英国首先制造成功。它是利用物体反射的电子束成像的，相当于光学显微镜的反射像。扫描电子显微镜景深大，放大倍率连续可变，特别适用于研究微小物体的立体形态和表面的微观结构。20世纪70年代以来，扫描电镜发展很快，在固体样品上可反射多种电子，结合信号分析装置，已成为研究物质表面结构的有力工具。扫描电镜的分辨率已由最初的500埃提高至5030埃。电子显微镜的另一个发展是研制超高压电镜以增加分辨率和对原样品的穿透力。制成了

10、3兆伏的加速电压的超高压电镜，可用来研究整体细胞和物质的分子结构像或原子结构像。1.2.2显微样品制备技术的产生和发展 1665年英国显微镜学家R胡克把软木切成薄片才在显微镜下观察到细胞。列文虎克在1714年用藏红花作肌纤维切片的染色，这一简单的切片和染色可以说是制片技术的萌芽。从18世纪20年代开始，德国一些研究工作者在染料的发展上作出了很大的贡献；而英国一些显微镜学家则热心于制片技术的研究。经过100多年的实践，至19世纪中期显微制片技术才逐渐完善。1863年W瓦尔代尔报告了用苏木精染色可以很好地显示染色体，也用于凋亡细胞的检测（陈彦红, 王廷华,2000）。1869年E克莱布斯最先采用石

11、蜡作为切片支持物来包埋材料。两年后，波姆和斯特里克勒把它发展为石蜡切片法。虽然早在1770年英国人卡明斯设计制作了切片机，但完善的转动式切片机直到1883年才由法伊弗在美国制造成功。这些重要的制片手段仍在使用。透射电镜样品制作的原理和操作与显微制片相似。1952年GE帕拉德采用缓冲的四氧化锇为固定剂获得良好的电镜图像，这一方法一直在延用。1949年纽曼采用二甲烯丙酸酯作为电镜样品切片的介质，获得了初步成功，后来改用了更合适的塑料，如环氧树脂Epon812。1953年KR波特和布卢姆首先采用了切超薄切片的超薄切片机，1950年拉塔和哈特曼偶然发现玻璃刀适合于超薄切片，从此玻璃刀成了电镜切片的主要

12、用刀，并且还在使用。当然费尔南德斯-莫兰发明的砧石刀效果更好，并且是制作连续切片所必不可少的。1950年吉本斯和布雷德菲尔德证明电子图像的细节可由重金属染色而增强，从而发展了广泛使用的电子染料（朱宜,张存硅，1983）。扫描电镜的样品制备比较简单。干燥的样品仅需金属涂膜使样品表面导电即可观察。生物材料一般需要固定、脱水、干燥和涂膜等步骤。此外，还可对所观察的对象进行各种手术，这种在显微镜下操作的技术称为显微操作。1.2.3 观察结果的记录、分析和处理 显微镜及电子显微镜下所见显微图像及其显示的信息是被观察物体和辐射波之间相互作用的效应，有些信息是可以直接用肉眼看到和识别的，有些则不能直接看到和

13、识别。因此对显微技术所获得的信息的接收、分析和处理就十分重要。光学显微镜所观察到的图像可为肉眼所接受和识别。这种直接观察的结果用描图仪依像勾画，即可记录；用显微摄影、显微电影或录像，则可更正确地记录。但在电子显微镜发展至高分辨率后，对极精细的结构，如对物质的分子或原子结构图的接收和解释，就会遇到许多困难，因为图像和样品的真实情况之间，在接收和显示中可能发生各种误差，不加校正和分析就无法获得理想的图像或做出正确的解释。这种对电子图像进行处理和分析的技术已发展成为一个专门的学科：生物图像处理技术。显微技术愈是深入的发展，图象处理技术愈益重要。1.2.4 显微技术的应用1819世纪显微技术的发展推动

14、了生物学，特别是细胞学的迅速发展。例如，19世纪后叶细胞学家对受精作用、染色体的结构和行为的研究，就是在不断改进显微技术的过程中取得很大成就的，而这些成就又为细胞遗传学的建立和发展打下了基础。此外，显微技术在细胞学、组织学、胚胎学、植物解剖学、微生物学、古生物学及孢粉学发展中，已成为一个主要研究手段。电子显微镜的发明促使生物学中微观现象的研究从显微水平发展到超显微水平。超微结构的研究结合生物化学的研究，使以形态描述为主的细胞学发展成为以研究细胞的生命活动基本规律为目的细胞生物学。20世纪70年代以来，由于电子显微镜分辨率的不断提高并与电子计算机的结合应用，许多分子生物学的现象，例如DNA转录、

15、DNA分子杂交等在生物化学中用同位素技术可证实的现象，也可在电子图像中获得直观的证实，许多生物大分子的结构和功能也可从电子图像的分析中加以认识。总之，利用显微技术进行的生物学研究可以反映细胞水平、超微结构水平，甚至分子水平三个不同的层次的信息。三者各具特点，同时又是相互联系和相互补充的。在医疗诊断中，显微技术已被用为常规的检查方法，如对血液、寄生虫卵、病原菌等的镜检等，如图1。利用显微技术作病理的研究已发展为一门专门的学科细胞病理学，它在癌症的诊断中特别重要。某些遗传病的诊断，已离不开用显微技术作染色体变异的检查，如图2。此外，在卫生防疫、环境保护、病虫害防治、检疫、中草药鉴定、石油探矿和地层

16、鉴定、木材鉴定、纤维品质检定、法医学、考古学、矿物学以及其它工业材料和工业产品的质量检查等方面，都有广泛的应用。 图 1 H1N1亚刑猪流感病毒电子显微图片 图 2显微镜下的人类非显带中期染色体1.3 微观到宏观的尺度1.3.1 物质世界的尺度 我们处在一个宏观与微观共存的世界中，从小到人眼无法看清的纳米级物质，到浩瀚无垠的宇宙，我们借助科技能较为精确的把握宏观与微观。当今是微观兴盛的时代，科技把我们带入到了一个极其微妙的微观物质世界中，如图3小到纳米级的生命大分子如DNA、蛋白质、RNA。其中有处于0.1nm的原子级如氢键，纳米级的生命物质葡萄糖。10-100纳米的有自组装分子如核糖体、线粒

17、体等亚细胞成分。大多数细胞处在微米级阶段，如1微米的细菌、10微米的红细胞。毫米级的可以为人眼观察到如黄蜂。图 3 从微观到宏观的物质世界1.3.2 人眼及显微镜的分辨极限人眼：人眼观察物体的能力是有限的。一般的情况下，在25cm的明视距离内，人眼的最小分辩视角为10（赵凤奎，2008）,人眼只能分辨相距0.1-0.2mm的两个物体。也就是说，当两个物体相距不到0.1mm的时候，人眼就会把它们看成是一个物体了。这个极限便称为人眼的分辨本领。 人眼视锥细胞直径为4微米，对应的视角约为30秒，这个角度就是视角的极限。一般要能清晰的分辨两个点，视角须在1分以上。高1米的物体距眼睛3400米时，视角为

18、1分。综上所述，人眼能看到物质的分辨极限为0.2mm。而借助于显微镜我们可将分辨率大大高，由于光的波长的限制，光学显微镜特别是激光共聚焦显微镜可以将分辨率提高到200nm，电子显微镜将这一极限有推进了一步，可以达到0.2nm。图4 人眼与显微镜的分辨率2. 普通光学复式显微镜显微镜是一种精密的光学仪器，已有300多年的发展史。自从有了显微镜，人们看到了过去看不到的许多微小生物和构成生物的基本单元细胞。目前，不仅有能放大千余倍的光学显微镜，而且有放大几十万倍的电子显微镜，使我们对生物体的生命活动规律有了更进一步的认识。在普通中学生物教学大纲中规定的实验中，大部分要通过显微镜来完成，因此，显微镜性

19、能的好坏是做好观察实验的关键。光学显微镜(light microscope)是生物科学和医学研究领域常用的仪器，它在细胞生物学、组织学、病理学、微生物学及其他有关学科的教学研究工作中有着极为广泛的用途，是研究人体及其他生物机体组织和细胞结构强有力的工具，如图5。图 5 普通光学显微镜实物图2.1 普通光学复式显微镜的工作原理2.1.1 显微镜的光学原理 折射和折射率.光线在均匀的各向同性介质中，两点之间以直线传播，当通过不同密介质的透明物体时，则发生折射现象，这是由于光在不同介质的传播速度不同造成的。 如图6凸透镜的五种成象规律： （1）、当物体位于透镜物方二倍焦距以外时，则在像方二倍焦距以内

20、、焦点以外形成缩小的倒立实像（2）、当物体位于透镜物方二倍焦距上时，则在像方二倍焦距上形成同样大小的倒立实像； （3）、当物体位于透镜物方二倍焦距以内，焦点以外时，则在像方二倍焦距以外形成放大的倒立实像；（4）、当物体位于透镜物方焦点上时，则像方不能成像；（5）、当物体位于透镜物方焦点以内时，则像方也无像的形成，而在透镜物方的同侧比物体远的位置形成放大的直立虚像.图 6 凸透镜成像规律2.1.2 显微镜的成像原理 显微镜和放大镜起着同样的作用，就是把近处的微小物体成一放大的像，以供人眼观察。只是显微镜比放大镜可以具有更高的放大率而已。物体位于物镜前方，离开物镜的距离大于物镜的焦距，但小于两倍物

21、镜焦距。所以，它经物镜以后，必然形成一个倒立的放大的实像。这个倒立的放大的实像靠近F2的位置上。再经目镜放大为虚像后供眼睛观察。目镜的作用与放大镜一样。所不同的只是眼睛通过目镜所看到的不是物体本身，而是物体被物镜所成的已经放大了一次的像。光学系统的显微镜主要由物镜、管镜和目镜组成。标本经物镜和管镜放大后，形成放大倒立的实像；实像经目镜再次放大后，形成放大的虚像。如图7所示，标本（AB）在物镜（Lo）焦点上，通过物镜（Lo）和管镜（Le）在象方形成放大倒立的实像（AB）；靠近人眼一方的目镜（Le）对中间像（AB）再次放大，在明视距离（对人眼来说约为 250mm）处形成一个虚像(A”B”)。人眼通

22、过显微镜所观察到的像就是 一个被放大了的虚像A”B”。 图7 光学显微镜成像原理2.2 显微镜的几个基本概念 2.2.1 光源能发射光波的物体。可见光频率范围：7.51014-3.91014 Hz。真空中对应的波长范围：390nm-760nm，相应光色：紫、蓝、青、绿、黄、橙、红。2.2.2 数值孔径 数值孔径简写NA，数值孔径是物镜和聚光镜的主要技术参数，是判断两者（尤其对物镜而言）性能高低的重要标志。其数值的大小，分别标刻在物镜和聚光镜的外壳上。 数值孔径（NA）是物镜前透镜与被检物体之间介质的折射率（n）和孔径角（u）半数的正弦之乘积。 孔径角又称镜口角，是物镜光轴上的物体点与物镜前透镜

23、的有效直径所形成的角度。孔径角越大，进入物镜的光通亮就越大，它与物镜的有效直径成正比，与焦点的距离成反比。 显微镜观察时，若想增大NA值，孔径角是无法增大的，唯一的办法是增大介质的折射率n值。基于这一原理，就产生了水浸物镜和油浸物镜，因介质的折射率n值大于1，NA值就能大于1。 数值孔径最大值为1.4，这个数值在理论上和技术上都达到了极限。目前，有用折射率高的溴萘作介质，溴萘的折射率为1.66,所以NA值可大于1.4。在观察时，聚光镜的NA值应等于或略大于物镜的NA值。 数值孔径与其他技术参数有着密切的关系，它几乎决定和影响着其他各项技术参数。它与分辨率成正比，与放大率成正比，与焦深成反比，N

24、A值增大，视场宽度与工作距离都会相应地变小。 2.2.3 分辨率 显微镜的分辨率是指能被显微镜清晰区分的两个物点的最小间距，其计算公式是=/NA式中为最小分辨距离；为光线的波长；NA为物镜的数值孔径。可见物镜的分辨率是由物镜的NA值与照明光源的波长两个因素决定。NA值越大，照明光线波长越短，则值越小，分辨率就越高。要提高分辨率，即减小值，可采取以下措施： 降低波长值，使用短波长光源; 增大介质n值以提高NA值（NA=nsinu/2）;增大孔径角u值以提高NA值; 增加明暗反差. 2.2.4 放大倍数显微镜的综合倍率是物镜倍率g1与目镜倍率g2的乘积，gg1g2。g1是1100倍，g2是520的

25、范围。显微镜的分辨力的大小由物镜的分辨力来决定的，而物镜的分辨力又是由它的数值孔径和照明光线的波长决定的。 当用普通的中央照明法（使光线均匀地透过标本的明视照明法）时，显微镜的分辨距离为：d=0.61/NA式中 d物镜的分辨距离，单位 nm。 照明光线波长，单位 nm。 NA 物镜的数值孔径 例如油浸物镜的数值孔径为1.25，可见光波长范围为400700nm ，取其平均波长550 nm，则d=270 nm，约等于照明光线波长一半。一般地，用可见光照明的显微镜分辨力的极限是0.2m。2.2.5 实际视野在显微镜上，限制视野的装置是视野光圈。以物镜侧观看这种视野光圈时的直径以mm单位表示，的值称为

26、视野数。实际视野视野。实际视野视野数物镜倍率。例如，视野数为20，则10物镜就观看2mm视野范围。应用聚光镜时，根据可变的视野光圈，再决定选用聚光镜的n.a.值，其值是取决於可变聚光镜孔径光圈来确定。2.3 光学显微镜的分类如图 8，我们可按不同的类别将光学显微镜分为不同类型的显微镜，它们所起的作用也是大不相同的。光学显微镜目镜数目光学原理光源类型 单目显微镜三目显微镜偏光显微镜荧光显微镜观察对象双目显微镜生物显微镜金相显微镜体视显微镜相衬显微镜微分干涉显微镜 紫外光显微镜 激光显微镜图8 光学显微镜的分类按目镜的数目分，我们可以将光学显微镜分为单目显微镜、双目显微镜、以及三目显微镜，现在多用

27、的为双目显微镜。按观察对象来分，我们可以将光学显微镜分为生物显微镜、金相显微镜和体视显微镜。生物显微镜是最常用的显微镜，尤其是在生物领域的研究内；体视显微镜:又称解剖显微镜、实体显微镜和立体显微镜，是用途比较多的显微镜。其操作简便，对标本要求不高，工作距离长，观察时有较强的立体感，可以对实物进行观察，也可以在观察的同时对标本进行一些操作。而不是像生物显微镜那样需要对标本进行切片处理，切片需要相应的技术和设备。因此，体视显微镜在微电子、精密仪器仪表装配与维修、微雕等领域有很广泛的应用。在生物、医学领域广泛用于解剖操作和显微外科手术（目前已归类为手术显微镜）,用于生物、医学领域其光源只能用冷光源（

28、光纤）；在工业中用于微小零件和集成电路的观测、装配、检查等工作；金相显微镜很多人都喜欢写成金像显微镜，金相显微镜是专门用于观察金属和矿物等不透明物体金相 组织的显微镜。这些不透明物体无法在普通的透射显微镜中观察，故相和普通显微镜的主要差别在于前者以反射光，而后者以透射光照明。在金相显微镜中照明光束从物镜方向射到被观察物体表面，被物面反射后再返回物镜成像。这种反射照明方式也广泛用于集成电路硅片的检测工作。按光学原理分，可以将光学显微镜分为偏光显微镜、相衬显微镜和微差干涉对比显微镜等。偏光显微镜是用于研究所谓透明与不透明各向异性材料（鉴定物质细微结构光学性质）的一种显微镜。凡具有双折射性的物质，在

29、偏光显微镜下就能分辨得清楚，当然这些物质也可用染色法来进行观察，但有些则不可能，而必须利用偏光显微镜,它是一种常用的对矿物质光学特性进行研究和鉴定的重要光学仪器之一，它的目的是检测偏振光通过透明光学晶体材料后偏振态的变化，通过检测样品的偏振特性确定样品的结构（孔凡美等，2008）；相衬显微镜又叫相差显微镜。通常用金相显微镜观察试样的显微组织，是靠试样表面反射光的强弱(即黑白灰度的不同)来鉴别它。有的显微组织由于其反射率和吸收率不同，而产生不同的灰度。反射率较大者，则组织较明亮；反射率较小者，组织比较灰暗。当试样上两相的反射系数相同，仅有因轻微浸蚀或各相硬度不同而使抛光时形成微小凹凸，或者有塑性

30、变形及第二类共格相变引起的表面浮凸，这时样品表面的反射光没有强度的差别，只有光程的微小差别。对此一般金相显微镜明场就不易鉴别，当表面高低起伏极小时，更难辨别，而相衬技术成功地解决了这一问题。一般表面高低差在1001500范围内均能用相衬显微镜来观察。相衬原理是荷兰的物理学家泽尔尼克(Zernike)于1934年建立，并在实际应用中获得巨大成就，曾获得1953年度的物理学诺贝尔奖。相衬显微分析是最成功的应用之一。当两束光通过光学系统时会发生相互干涉，如果相位相同，干涉的结果是亮度增强，反之，就会相互抵消变暗，这就是光波的干涉现象。微分干涉显微镜是以平面偏振光为光源，光线经棱镜折射后分成两束，在不

31、同时间经过样品的相邻部位，然后经过另一棱镜将这两束光汇合，相的改变就是透射光所携带的样品信息，从而样品中厚度上的微小差别就会转化成明暗区别，增加了样品反差，造成了标本的人为三维立体感，类似大理石上的浮雕（吴德邦, 邹利元，1999）。微分干涉显微镜适于研究活细胞中较大的细胞器，如果接上录像装置可以记录活细胞中的颗粒以及细胞器的运动。按光源类型分，我们可以将光学显微镜分为普通光显微镜、荧光显微镜、紫外光显微镜、红外光显微镜和激光显微镜等。可见光的波长范围在0.770.39微米之间。波长不同的电磁波，引起人眼的颜色感觉不同。0.770.622微米为红色，0.6220.597微米为橙色，0.5970

32、.577微米为黄色，0.5770.492微米为绿色，0.4920.455微米为蓝靛色，0.4550.39微米为紫色，红外线波长范围在0.8-100 微米，紫外线的波长范围在100400微米。激光具有定向发光、亮度极高、颜色极纯、能量密度极大等优点，已被广泛应用于显微镜中作为光源。2.4 显微镜的构造光学显微镜主要有两大部分组成，分别为机械部分和光学系统部分，如图9。1.目头；2.目镜；3.物镜固紧螺钉；4.转换器；5.物镜；6.载物台；7.聚光镜升降手轮；8.聚光镜；9.聚光镜（带孔径光阑）；10.下聚光版；11.亮度旋钮；12.电源开关； 13.横向移动手轮；14.纵向移动手轮；15.细准焦

33、螺旋；16.粗准焦螺旋；17. 标本夹持器；18.镜臂；19.单目头（镜筒）；20.三木头（镜筒）；21.三目头（镜筒）；22镜座图 9 光学显微镜的构造2.4.1 光学显微镜的机械部分显微镜主机体显微镜的主机体设计成金字塔形，而底座的截面呈T字形，使显微镜的整体相当稳固。显微镜的光学部件和机构调节部件、光源的灯室、显微照相装置、电源变压稳压器等，都可安装在主机体上或主机体内。电源开关与亮度调节旋钮电源开关用来接通或切断显微镜所需用的交流电源。电源开关旋钮也可调节照明光源的亮度，使所观察的视域可随时获得适当的亮度，可调范围为3-12V。作显微照相时，可根据曝光以及彩色底片色温的要求来调节灯光的

34、亮度。当准备关掉电源之前，应先将亮度调节旋钮调到最小。透射光用的滤光片选择按钮透射光显微镜检方法所需用的一组滤光片已安装在显微镜的底座内，通过底座外的按钮就可以根据不同的需要来选择适用的一块或一组滤光片。通常的滤光片配套有： （1）、蓝色色温转换滤光片：用来把光源的色温由3200K转换成日光型彩色底片所需 的5500K色温；（2）、绿色滤光片：用来增强相差观察方法中成像的反差，或者以黑白底片作显微照相时，可以提高片成像的反差； （3）、浅灰色滤光片：是透光率为50%的中性减光滤光片，可把视野的亮度减弱一半； （4）、灰色滤光片：是透光率为25%的中性减光滤光片，可把视野的高度减弱75%； （5

35、）、透光率仅为6%的中性减光滤光片，可把视野的亮度变得相当暗，95%以上的光都已被吸收掉。光源的视场光阑视场光阑是显微镜照明光路系统中的重要部件之一，它只能按照库勒照明系统的要求来进行调节，视场光阑不可以任意开大，但要根据使用的物镜倍数来调节适当的大小。视场光阑的主要功用有：（1）、控制杂散光在成像光路系统中的影响，特别是免除杂散光对照相系统的干扰，使显微照相的底片不至于蒙上一层灰雾； （2）、控制照明光束的大小，使所观察的视域能受到均匀的照明； （3）、在荧光显微镜检方法中，可以把激发光限制在所需激发样品的视域范围内，以防止视域外的样品过早受到激发。 镜筒：为安装在光镜最上方或镜臂前方的圆筒

36、状结构，其上端装有目镜，下端与物镜转换器相连。根据镜筒的数目，光镜可分为单筒式或双筒式两类。单筒光镜又分为直立式和倾斜式两种。而双筒式光镜的镜筒均为倾斜的。镜筒直立式光镜的目镜与物镜的中心线互成45度角，在其镜筒中装有能使光线折转45度的棱镜。 物镜转换器：又称物镜转换盘。是安装在镜筒下方的一圆盘状构造，可以按顺时针或反时针方向自由旋转。其上均匀分布有34个圆孔，用以装载不同放大倍数的物镜。转动物镜转换盘可使不同的物镜到达工作位置（即与光路合轴）。使用时注意凭手感使所需物镜准确到位。镜臂：为支持镜筒和镜台的弯曲状构造，是取用显微镜时握拿的部位。镜筒直立式光镜在镜臂与其下方的镜柱之间有一倾斜关节

37、，可使镜筒向后倾斜一定角度以方便观察，但使用时倾斜角度不应超过45度，否则显微镜则由于重心偏移容易翻倒。在使用临时装片时，千万不要倾斜镜臂，以免液体或染液流出，污染显微镜。调焦器：也称调焦螺旋，为调节焦距的装置，位于镜臂的上端（镜筒直立式光镜）或下端（镜筒倾斜式光镜），分粗调螺旋（大螺旋）和细调螺旋（小螺旋）两种。粗调螺旋可使镜筒或载物台以较快速度或较大幅度的升降，能迅速调节好焦距使物像呈现在视野中，适于低倍镜观察时的调焦。而细调螺旋只能使镜筒或载物台缓慢或较小幅度的升降（升或降的距离不易被肉眼观察到），适用于高倍镜和油镜的聚焦或观察标本的不同层次，一般在粗调螺旋调焦的基础上再使用细调焦螺旋，

38、精细调节焦距。有些类型的光镜，粗调螺旋和细调螺旋重合在一起，安装在镜柱的两侧。左右侧粗调螺旋的内侧有一窄环，称为粗调松紧调节轮，其功能是调节粗调螺旋的松紧度（向外转偏松，向内转偏紧）。另外，在左侧粗调螺旋的内侧有一粗调限位环凸柄，当用粗调螺旋调准焦距后向上推紧该柄，可使粗调螺旋限位，此时镜台不能继续上升但细调旋仍可调节。载物台：也称镜台，是位于物镜转换器下方的方形平台，是放置被观察的玻片标本的地方。平台的中央有一圆孔，称为通光孔，来自下方光线经此孔照射到标本上。在载物台上通常装有标本移动器（也称标本推进器），移动器上安装的弹簧夹可用于固定玻片标本，另外，转动与移动器相连的两个螺旋可使玻片标本前

39、后左右地移动，这样寻找物像时较为方便。在标本移动器上一般还附有纵横游标尺，可以计算标本移动的距离和确定标本的位置。游标尺一般由主标尺（A）和副标尺（B）组成。副标尺的分度为主标尺的910。使用时先看到标尺的0点位置，再看主副标尺刻度线的重合点即可读出准确的数值镜柱：为镜臂与镜座相连的短柱。镜座：位于显微镜最底部的构造，为整个显微镜的基座，用于支持和稳定镜体。有的显微镜在镜座内装有照明光源等构造。2.4.2 光学系统部分光镜的光学系统主要包括物镜、目镜和照明装置（反光镜、聚光器和光圈等）。目镜：又称接目镜，安装在镜筒的上端，起着将物镜所放大的物像进一步放大的作用。每个目镜一般由两个透镜组成，在上

40、下两透镜（即接目透镜和会聚透镜）之间安装有能决定视野大小的金属光阑视场光阑，此光阑的位置即是物镜所放大实像的位置，故可将一小段头发粘附在光阑上作为指针，用以指示视野中的某一部分供他人观察。另外，还可在光阑的上面安装目镜测微尺。每台显微镜通常配置23个不同放大倍率的目镜，常见的有5、10和15（表示放大倍数）的目镜，可根据不同的需要选择使用，最常使用的是10目镜。物镜：也称接物镜，安装在物镜转换器上。每台光镜一般有34之个不同放大倍率的物镜，每个物镜由数片凸透镜和凹透镜组合而成，是显微镜最主要的光学部件，决定着光镜分辨力的高低。常用物镜的放大倍数有10、40和100等几种。一般将8或10的物镜称

41、为低倍镜（而将5以下的叫做放大镜）；将40或45的称为高倍镜；将90或100的称为油镜（这种镜头在使用时需浸在镜油中）。在每个物镜上通常都刻有能反映其主要性能的参数，主要有放大倍数和数值孔径（如10025、400.65和1001.25），该物镜所要求的镜筒长度和标本上的盖玻片厚度（1600.17，单位 mm）等，另外，在油镜上还常标有“油”或“Oil”的字样。油镜在使用时需要用香柏油或石蜡油作为介质，这是因为油镜的透镜和镜孔较小，而光线要通过载玻片和空气才能进入物镜中，玻璃与空气的折光率不同，使部分光线产生折射而损失掉，导致进入物镜的光线减少，而使视野暗淡，物像不清。在玻片标本和油镜之间填充折

42、射率与玻璃近似的香柏油或石蜡油时（玻璃、香柏油和石蜡油的折射率分别为1.52、1.51、1.46，空气为1），可减少光线的折射，增加视野亮度，提高分辨率，其中香柏油的优点是折射率较大(151)，与空气介质(折射率为1)相比，可以大大提高显微镜的数值孔径（魏纳新等，2004）。物镜分辨力的大小取决于物镜的数值孔径（numerial aperture,N.A.），N.A.又称为镜口率，其数值越大，则表示分辨力越高。不同的物镜有不同的工作距离。所谓工作距离是指显微镜处于工作状态（焦距调好、物像清晰）时，物镜最下端与盖玻片上表面之间的距离。物镜的放大倍数与其工作距离成反比。当低倍镜被调节到工作距离后，

43、可直接转换高倍镜或油镜，只需要用细调螺旋稍加调节焦距便可见到清晰的物像，这种情况称为同高调焦。不同放大倍数的物镜也可从外形上加以区别，一般来说，物镜的长度与放大倍数成正比，低倍镜最短，油镜最长，而高倍镜的长度介于两者之间。聚光器：位于载物台的通光孔的下方，由聚光镜和光圈构成，其主要功能是光线集中到所要观察的标本上。聚光镜由23个透镜组合而成，其作用相当于一个凸透镜，可将光线汇集成束。在聚光器的左下方有一调节螺旋可使其上升或下降，从而调节光线的强弱，升高聚光器可使光线增强，反之则光线变弱。光圈也称为彩虹阑或孔径光阑，位于聚光器的下端，是一种能控制进入聚光器的光束大小的可变光阑。它由十几张金属薄片

44、组合排列而成，其外侧有一小柄，可使光圈的孔径开大或缩小，以调节光线的强弱。在光圈的下方常装有滤光片框，可放置不同颜色的滤光片。反光镜：位于聚光镜的下方，可向各方向转动，能将来自不同方向的光线反射到聚光器中。反光镜有两个面，一面为平面镜，另一面为凹面镜，凹面镜有聚光作用，适于较弱光和散射光下使用，光线较强时则选用平面镜（现在有些新型的光学显微镜都有自带光源，而没有反光镜；有的二者都配置）。2.5 光学显微镜的使用方法2.5.1 显微镜使用操作准备 将显微镜小心地从镜箱中取出（移动显微镜时应以右手握住镜壁，左手托住镜座），放置在实验台的偏左侧，以镜座的后端离实验台边缘约610cm为宜。首先检查显微

45、镜的各个部件是否完整和正常。如果是镜筒直立式光镜，可使镜筒倾斜一定角度（一般不应超过45度）以方便观察（观察临时装片时禁止倾斜镜臂）。低倍镜的使用方法: 对光：打开实验台上的工作灯（如果是自带光源显微镜，这时应该打开显微镜上的电源开关），转动粗调螺旋，使镜筒略升高（或使载物台下降），调节物镜转换器，使低倍镜转到工作状态（即对准通光孔），当镜头完全到位时，可听到轻微的扣碰声。打开光圈并使聚光器上升到适当位置（以聚光镜上端透镜平面稍低于载物台平面的高度为宜）。然后用左眼向着目镜内观察（注意两眼应同时睁开），同时调节反光镜的方向（自带光源显微镜，调节亮度旋钮），使视野内的光线均匀、亮度适中。放置玻片

46、标本：将玻片标本放置到载物台上用标本移动器上的弹簧夹固定好（注意：使有盖玻片或有标本的一面朝上），然后转动标本移动器的螺旋，使需要观察的标本部位对准通光孔的中央。调节焦距：用眼睛从侧面注视低倍镜，同时用粗调螺旋使镜头下降（或载物台上升），直至低倍镜头距玻片标本的距离小于0.6cm（注意操作时必须从侧面注视镜头与玻片的距离，以避免镜头碰破玻片）。然后用左眼在目镜上观察，同时用左手慢慢转动粗调螺旋使镜筒上升（或使载物台下降）直至视野中出现物像为止，再转动细调螺旋，使视野中的物像最清晰。如果需要观察的物像不在视野中央，甚至不在视野内，可用标本移动器前后、左右移动标本的位置，使物像进入视野并移至中央。

47、在调焦时如果镜头与玻片标本的距离已超过了1cm还未见到物像时，应严格按上述步骤重新操作。高倍镜的使用方法:在使用高倍镜观察标本前，应先用低倍镜寻找到需观察的物像，并将其移至视野中央，同时调准焦距，使被观察的物像最清晰。转动物镜转换器，直接使高倍镜转到工作状态（对准通光孔），此时，视野中一般可见到不太清晰的物像，只需调节细调焦螺旋,一般都可使物像清晰。注意：（1）在从低倍镜准焦的状态下直接转换到高倍镜时，有时会发生高倍物镜碰擦玻片而不能转换到位的情况（这种情况，主要是高倍镜、低倍镜不配套，即不是同一型号的显微镜上的镜头），此时不能硬转，应检查玻片是否放反、低倍镜的焦距是否调好以及物镜是否松动等情况后重新操作。如果调整后仍不能转换，则应将镜筒升高（或使载物台下降）后再转换，然后在眼睛的注视下使高倍镜贴近盖玻片，再一边观察目镜视野，一边用粗调螺旋使镜头极其缓慢地上升（或载物台下降），看