过氧化氢酶米氏常数的测定 (1).doc

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1、生化实验 过氧化氢酶米氏常数的测定 傅璐121140012 2013/11/28过氧化氢酶米氏常数的测定傅璐121140012一、 实验目的 1. 了解米氏常数的测定方法 2. 学习提取生物组织中的酶 二、 实验原理1. 米氏反应动力学 米氏方程 (Michaelis-Menten Equation):2. 米氏常数的意义： 反映酶的种类：Km是一种酶的特征常数，只与酶的种类有关，与酶浓度、底物浓度无关。 米氏常数是酶促反应达到最大反应速度Vmax一半时的底物浓度。其数值大小反映了酶与底物之间的亲和力：Km值越大，亲和力越弱，反之Km值越小，亲和能力越强。 Km可用来判断酶（多功能酶）的最适底

2、物：Km值最小的酶促反应对应底物就是该酶的最适底物。3.米氏常数的求法：该方法的缺点是难以确定最大反应速度Vmax。该作图法应用最广。但在低浓度是v值误差较大，在S等差值实验时作图点较集中于纵轴。因此在设计底物浓度时，最好将1/S配成等差数列，这样可使点距较为平均，再配以最小二乘回归法，就可以得到较为准确的结果。此法优点是横轴上点分布均匀，缺点是1/v会放大误差，同时对底物浓度的选择有要求。SKm时直线将在原点附近与轴相交。4.氧化酶：生物体内重要的三种氧化酶类，其作用均是消除体内自由基：POD：过氧化物酶SOD:超氧化物歧化酶CAT：；过氧化氢酶5.过氧化氢酶的作用：植物体内活性氧代谢加强而

3、使过氧化氢发生积累。过氧化氢可进行一步生成氢氧自由基。氢氧自由基是化学性质最活泼的活性氧，可以直接或间接地氧化细胞内核酸、蛋白质等生物大分子，并且有非常高的速度常数，破坏性极强，可使细胞膜遭受损害，加速细胞的衰老和解体。过氧化氢酶（catalase，CAT）可以清除过氧化氢、分解氢氧自由基，保护机体细胞稳定的内环境及细胞的正常生活，因此CAT是植物体内重要的酶促防御系统之一，其活性高低与植物的抗逆性密切相关。6.过氧化氢酶活力的测定方法：紫外吸收法：过氧化氢在240nm波长下有强烈吸收，过氧化氢酶能分解过氧化氢，使反应溶液吸光度（A240nm）随反应时间而降低。根据测量吸光度的变化速度即可测出

4、过氧化氢酶的活性。（以一分钟内A240nm下降0.1为一个单位）滴定法（高锰酸钾法、碘量法）在反应系统中加入一定量（反应过量）的过氧化氢溶液，经酶促反应后，用标准高锰酸钾溶液（在酸性条件下）滴定多余的过氧化氢。根据单位时间内消耗的过氧化氢的量即可测出过氧化氢酶活力大小。7.实验中的反应 ：H2O2被过氧化氢酶分解出 H2O 和 O2 , 未分解的 H2O2 用 KMnO4 在酸性环境中滴定, 根据反应前后的浓度差可以算出反应速度: 酶2H2O2 2H2O + O2 2KMnO4+5H2O2+3H2SO4 2MnO4+K2SO4+8H2O+5O2 （本实验以马铃薯提供过氧化氢酶）三、 实验试剂

5、1. 0.02mol/L 磷酸缓冲溶液 (pH=7.0): 实验室提供. 2. 酶液: 称取马铃薯 5g, 加缓冲液 10mL, 匀浆过滤. 3. 0.01mol/L 高锰酸钾.4. 0.098mol/L H2O2. 5. 25%H2SO4. 四、 实验操作 取 6 只锥形瓶, 按下表的顺序加入试剂. 先加好过氧化氢和蒸馏水, 加酶液后立即混合, 依次记录各瓶的起始反应时间. 反映到达 5min 立即加入2ml 25%硫酸终止反应, 充分混匀.。用 0.01mol/L 的 KMnO4溶液滴定瓶中剩余的过氧化氢至微红色, 记录消耗的高锰酸钾体积.。 五、注意事项：1.反应时间必须准确。2.酶浓度

6、须均一，若酶活力过大，应适当稀释。3.滴定终点的判定。六、实验结果：过氧化氢浓度：0.098mol/L称取马铃薯的质量：5.00g高锰酸钾：0.01mol/L序号1345V（KMnO4）/ml2.74.46.3212.4S/(mol/L)0.00980.0163680.02450.049v/(mmol/min)0.00610.0107320.01740.0361/S102.040861.094840.816320.40821/v163.934493.179357.471327.7778米氏常数Km= -0.1913七、实验结果分析：1.曲线上少一个点的原因：用移液管移取序号为2的过氧化氢溶液（应为1.25ml）错误的移取了1.75ml，故在制图时将其舍去。2.曲线线性较好（R=0.9988）的原因：本实验采取了两人分工的方法完成实验，控制反应结束及滴定分别由一人完成，所以标准都相同，从而在一定程度上提高了实验的准确性。3. Km计算结果呈负值的原因：Km呈负值（即整条直线都向下移动），亦即所有测定的v值都偏大。由v=(c1*V1-2.5*c2*V2)/5，故推断最可能的原因是V2整体测量偏小，可能的操作失误是编号为0的空白对照组中高锰酸钾的滴加量偏高，从而使除去该点的整体的高锰酸钾量都偏小。