流式细胞仪微生物应用.ppt

1、BD Technologies 流式细胞仪与微生物研究BD BiosciencesBD BiosciencesBD Technologies 流式细胞仪可以用来干什么流式细胞仪可以用来干什么?染色体微生物：细菌、病毒、真菌血细胞原生动物细胞BD Technologies 流式细胞仪流式细胞仪-了解细胞的特征了解细胞的特征BD Technologies 流式细胞仪如何检测细菌？流式细胞仪如何检测细菌？细菌自发荧光标记不同的荧光素（蛋白、核酸等）散射光强阳性弱阳性阴性BD Technologies 流式细胞仪如何检测细菌？流式细胞仪如何检测细菌？在流动的状态中检测细菌各种物理及生物特征；Injec

2、tor Tip荧光信号聚焦的激光光束鞘液细胞BD Technologies 流式细胞仪上检测两类信号流式细胞仪上检测两类信号散射光信号主要反映细胞大小和内部结构如颗粒荧光信号来自于荧光素：荧光素标记细胞成份如蛋白和DNA来自于细胞自发荧光BD Technologies 前向角散射光信号前向角散射光信号前向角检测器前向角检测器激光激光细胞细胞BD Technologies 侧向角散射光信号侧向角散射光信号前向角检测器前向角检测器侧向角检测器侧向角检测器激光激光BD Technologies 荧光信号荧光信号BD Technologies PMTPMTPMTPMT滤片滤片带通滤片带通滤片流式细胞仪

3、原理流式细胞仪原理激光激光1234流动室流动室检测器光电倍增管BD Technologies 荧光信号荧光信号BD Technologies 荧光信号荧光信号BD Technologies 流式细胞仪的数据分析流式细胞仪的数据分析常用图形单参数直方图 双参数点图BD Technologies 流式细胞仪的应用流式细胞仪的应用临床医学微生物学海洋渔业食品酿酒畜牧体育科学农业林业化工BD Technologies 流式细胞仪在微生物学的应用历史流式细胞仪在微生物学的应用历史最早期流式细胞仪，被用于检测矿尘中的浮质颗粒二次世界大战中美军实验室检测细菌和孢子40年代末，报导显示流式细胞仪可用于检测生物

4、样本（细菌）、悬浮在空气中及浮质中的颗粒70年代，随着商业流式细胞仪的发展，用流式细胞仪研究哺乳类生物细胞发展迅速随着流式细胞仪光学系统的改进及发现新的荧光素，流式细胞仪在微生物学中的应用开始发展上世纪90年代末，微生物学对流式细胞仪的应用快速发展起来BD Technologies 流式细胞仪在微生物研究中的应用流式细胞仪在微生物研究中的应用DNA蛋白过氧化物生成胞内pH鉴别死/活细菌和酵母菌并计数区分革兰氏阳/阴性细菌研究酵母菌细胞器基因表达-绿色荧光蛋白病原菌与吞噬细胞的关系-吞噬引起的呼吸爆发病毒-细胞相互作用：病毒感染导致细胞蛋白表达的改变，对细胞周期的干扰，对细胞内钙离子水平的影响病

5、毒引起的凋亡BD Technologies 流式细胞仪在微生物中的应用流式细胞仪在微生物中的应用鉴别细菌的活性环境、饥饿对细菌膜电位的影响可以通过荧光素标记区分死细菌、活细菌自发荧光利用NADPH和黄素的自发荧光作为代谢状态的标记细菌分类通过两个参数：散射光信号和荧光信号（与细胞成份如蛋白或DNA结合的荧光素发出的信号）或自发荧光BD Technologies 细胞生理学研究细胞生理学研究细菌分类BD Technologies 流式细胞仪在微生物中的应用流式细胞仪在微生物中的应用细菌分类BD Technologies 流式细胞仪在微生物中的应用流式细胞仪在微生物中的应用不同的藻类分群BD Te

6、chnologies 流式细胞仪在微生物中的应用流式细胞仪在微生物中的应用根据生理状态的功能将细胞分类增殖活性、代谢活性、膜完整性分类细胞胞膜内外形成电位差。完整极化的有主动转运系统的细胞膜是健康、功能良好的细胞的基本条件。本来不能通透的染料进入胞内，反映了胞膜的受损。主动转运系统停止时，BOX染料进入胞内胞膜受损时，PI染料与DNA结合EB可进入胞内，但被健康的细胞泵出BD Technologies 流式细胞仪在微生物中的应用流式细胞仪在微生物中的应用根据生理状态的功能将细胞分类大肠杆菌在600加热30秒后用PI和BOX染色健康细胞失去膜电位细胞通透细胞BD Technologies 流式细

7、胞仪在微生物中的应用流式细胞仪在微生物中的应用根据生理状态的功能将细胞分类红球菌在600加热30秒后，用EB和PI染色健康细胞活细胞但失去泵的能力完整细胞，但失去泵的能力并去极化死细胞BD Technologies 流式细胞仪在微生物中的应用流式细胞仪在微生物中的应用分析革兰氏阴性细菌检测血清特异性菌株BD Technologies 流式细胞仪在微生物中的应用流式细胞仪在微生物中的应用分析革兰氏阴性细菌菌株与接种疫苗前后的血清反应，检测抗原特异性免疫球蛋白亚型BD Technologies 流式细胞仪在微生物中的应用流式细胞仪在微生物中的应用检测食品中的细菌-用荧光抗体检测细菌表面的抗原在牛肉

8、中检测到O157:H7在牛肉中未检测到O157:H7O157:H7BD Technologies 流式细胞仪在微生物中的应用流式细胞仪在微生物中的应用胞内pH值检测荧光探针DCH*BCECF BCECF-AM SNAFLs SNARFsSNAFLs SNARFs应用测细胞的pH值-胞内酸度的改变是细胞凋亡时常见的现象各种刺激对pH值的影响Na+/H+（NHE）交换泵的功能 BD Technologies 流式细胞仪在微生物中的应用流式细胞仪在微生物中的应用胞内pH值的检测BD Technologies 流式细胞仪在微生物中的应用流式细胞仪在微生物中的应用细胞膜电位的改变膜电位对细菌的生理状态极

9、其重要超极化的细胞摄取更多的染料，细胞总的荧光强度增大；细胞去极化时，染料释放到细胞外，总的荧光强度减少。染料和试剂DiOC6(3)DiOC5(3)DiOC1(3)DiOC1(5)Valinomycin Gramicidin D CCCPBD Technologies 流式细胞仪在微生物中的应用流式细胞仪在微生物中的应用细胞膜电位的改变BD Technologies 流式细胞仪在微生物中的应用流式细胞仪在微生物中的应用利用流式细胞仪可精确检测细菌膜电位BD Technologies 流式细胞仪在微生物中的应用流式细胞仪在微生物中的应用细菌死/活鉴定活细胞有完整的细胞膜，一些荧光染料如PI无法进

10、入活细胞胞内，只能进入膜受损的细胞。染料TO是透膜染料，可进入所有细胞内，包括死细胞和活细胞，不过进入的量有所不同。这两种染料结合起来配合荧光微球可快速，可靠鉴别并计数死/活细菌。可用于食品、工业生产、杀菌效果的评价等 BD Technologies 流式细胞仪在微生物中的应用流式细胞仪在微生物中的应用鉴别并计数死/活细菌 TOPIBD Technologies 流式细胞仪在微生物中的应用流式细胞仪在微生物中的应用鉴别并计数死/活细菌枯草杆菌假单胞菌沙门氏菌BD Technologies 流式细胞仪在微生物中的应用流式细胞仪在微生物中的应用鉴别并计数死/活细菌酿酒业中计数活的酵母菌BD Tec

11、hnologies 流式细胞仪在微生物中的应用流式细胞仪在微生物中的应用鉴别死/活细菌对环境中难培养的细菌尤为重要BD Technologies 流式细胞仪在微生物中的应用流式细胞仪在微生物中的应用鉴别死/活细菌评价杀菌剂的效果BD Technologies 流式细胞仪在微生物中的应用流式细胞仪在微生物中的应用研究细菌的代谢-半乳糖苷酶活性 C8FDG（酶底物）和PKH26利用流式细胞术研究枯草杆菌差异培养BD Technologies 流式细胞仪在微生物中的应用流式细胞仪在微生物中的应用BD Technologies 流式细胞仪在微生物中的应用流式细胞仪在微生物中的应用研究细菌的代谢 Flu

12、orescein Diacetate是不发荧光、无极性、亲脂性分子，可以透过细胞膜后扩散。进入活细胞后,被胞内酯酶降解,生成荧光底物.活细胞会发绿色荧光BD Technologies 流式细胞仪在微生物中的应用流式细胞仪在微生物中的应用细胞活性分析-在酸性环境或盐的干扰下，检测乳酸菌的活性 随着盐浓度的增高，活细胞减少，死细胞增多TOTO-1是核酸染料，标记死细胞BD Technologies 流式细胞仪在微生物中的应用流式细胞仪在微生物中的应用细胞活性分析-在酸性环境或盐的干扰下，检测乳酸菌的活性随着PH值的改变，死细胞增多BD Technologies 流式细胞仪在微生物中的应用流式细胞仪

13、在微生物中的应用在酸性环境中作用不同时间酵母菌的活性改变BD Technologies 流式细胞仪在微生物中的应用流式细胞仪在微生物中的应用重金属污染对微生物的影响BD Technologies 流式细胞仪在微生物中的应用流式细胞仪在微生物中的应用BD Technologies 流式细胞仪在微生物中的应用流式细胞仪在微生物中的应用利用核酸荧光探针检测特异的细菌并定量分析BD Technologies 流式细胞仪在微生物中的应用流式细胞仪在微生物中的应用细胞活性分析-冻干的发酵样本BD Technologies 细胞生理学研究细胞生理学研究检测细胞的吞噬功能细胞与微球孵育后在流式细胞仪上检测的图BD Technologies 细胞生理学研究细胞生理学研究细胞活力分析CFSE(Carboxyfluorescein Succinimidyl ester)是一种亲脂性染料，可被细胞膜吸收。细胞标记CFSE后再诱导增殖，分裂后的细胞将含半量的CFSE，如此可监控细胞分裂的数目。BD Technologies 细胞生理学研究细胞生理学研究细胞活力分析上图中人T细胞被标记并刺激后，可跟踪六代的分裂。如果配合使用Modfit软件分析，可确定每代的细胞数。BD Technologies 谢谢大家