化学生物学中探针标记技术.ppt

1、探针探针标记标记Target identificationNucleic acidsProteinsSequence-specific Sequence-nonspecific Intercalating dye Complementary oligomers,molecular beacon GeneticlabelingImmunolabelingEnzymesubstrate蛋白荧光标记具有灵敏度高、选择性好、动态响应范蛋白荧光标记具有灵敏度高、选择性好、动态响应范围宽以及测定条件更接近生命体的生理环境等优点。围宽以及测定条件更接近生命体的生理环境等优点。蛋白质荧光标记的重要性蛋白质荧光

2、标记的重要性u蛋白质是细胞功能的执行者，在许多情况下，一个细胞功能蛋白质是细胞功能的执行者，在许多情况下，一个细胞功能的实现是多个蛋白质分子相互作用的结果。的实现是多个蛋白质分子相互作用的结果。u许多重要的生命过程，如多亚单位蛋白质复合体形成、细胞许多重要的生命过程，如多亚单位蛋白质复合体形成、细胞内信号转导、基因转录、蛋白质转运、蛋白质修饰和降解等，内信号转导、基因转录、蛋白质转运、蛋白质修饰和降解等，都依赖于蛋白质之间或蛋白质与核酸之间的相互作用。都依赖于蛋白质之间或蛋白质与核酸之间的相互作用。Target probe generationNucleic acid-based affini

3、ty molecules:nucleic acid aptamersPeptide-or protein-based affinity molecules:antibodies and antibody-like proteinsIn vitro SELEX(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment)指数富集的配基系统进化探针获取探针获取Natural Human Antibody and Its FragmentsNature Biotechnology,2005,23,1126.单链抗体抗原结合片段antigen-b

4、indingfragment各种展示技术各种展示技术(基因型表观型偶联基因型表观型偶联)Advanced Drug Delivery Reviews,2006,58,1622.u Non-covalent conjugation system：-Phage display -Cell display (bacterial,yeast and mammalian)-Ribosome displayu Covalent conjugation system：-mRNA-display Science,312,217-224(2006).Science,312,217-224(2006).蛋白质的特

5、异性荧光标记蛋白质的特异性荧光标记u天然的蛋白荧光探针天然的蛋白荧光探针 绿色荧光蛋白及其变体绿色荧光蛋白及其变体u小分子蛋白荧光探针小分子蛋白荧光探针 立体位阻小、量子产率高、稳定性强、标记速度快立体位阻小、量子产率高、稳定性强、标记速度快,并且能够提供除了荧光之外的读出等并且能够提供除了荧光之外的读出等 非定点荧光标记、定点荧光标记非定点荧光标记、定点荧光标记20082008年诺贝尔化学奖揭晓年诺贝尔化学奖揭晓2008年10月8日，瑞典皇家科学院在瑞典首都斯德哥尔摩宣布，日本科学家下村修、美国科学家马丁沙尔菲和美籍华裔科学家钱永健因在发现和研究绿色荧光绿色荧光蛋白蛋白方面做出贡献而分享今年

6、的诺贝尔化学奖。OsamuShimomura（下村修）MartinChalfie马丁沙尔菲RogerY.Tsien钱永健GFP的生物应用u绿色荧光蛋白是当代科学和医学领域最重要绿色荧光蛋白是当代科学和医学领域最重要的工具之一，它从显微水平上照亮了生命。的工具之一，它从显微水平上照亮了生命。u通过通过DNA技术，研究人员现在能够将技术，研究人员现在能够将GFP和和其他有趣但却不可见的蛋白联系起来。发光其他有趣但却不可见的蛋白联系起来。发光标记使科学家能够观察蛋白的运动、位置以标记使科学家能够观察蛋白的运动、位置以及相互作用。及相互作用。u瑞典皇家科学院在新闻公报中说，绿色荧光瑞典皇家科学院在新闻

7、公报中说，绿色荧光蛋白蛋白“已经成为现代生物科学研究领域最重已经成为现代生物科学研究领域最重要的工具之一要的工具之一”。GFPGFP之美丽和妙用之美丽和妙用GFPGFP及其衍生物（各种荧光蛋白），绚丽多彩，及其衍生物（各种荧光蛋白），绚丽多彩，非常漂亮。非常漂亮。绿色荧光蛋白绿色荧光蛋白GFPGFP的最初发现者的最初发现者1928年出生于日本京都府，1960年获得名古屋大学有机化学博士学位后赴美，先后在美国普林斯顿大学、波士顿大学和伍兹霍尔海洋生物实验所工作。他1962年从一种水母中发现了荧光蛋白，被誉为生物发光研究第一人。美国WoodsHole海洋生物学实验室的OsamuShimomura（

8、下村修），首次从Aequoreavictoria（一种随北美西海岸洋流漂移的水母）中分离出GFP。他发现该蛋白在紫外线下会发出明亮的绿光。OsamuShimomuraGFPGFP作为发光的遗传标签作为发光的遗传标签Martin Chalfie证明了GFP作为多种生物学现象的发光遗传标记的价值。在最初的一项实验中，他用GFP使秀丽隐杆线虫的6个单独细胞有了颜色。马丁沙尔菲，1947年出生，1977年获得美国哈佛大学神经生物学博士学位，1982年起任美国哥伦比亚大学生物学教授。他获奖的主要贡献在于向人们展示了绿色荧光蛋白作为发光的遗传标签的作用，这一技术被广泛运用于生理学和医学等领域。诺贝尔奖评审

9、委员会说，这种蛋白已经成为同时代生物科学研究最重要的工具之一。MartinChalfie20082008年诺贝尔化学奖揭晓年诺贝尔化学奖揭晓钱永健的主要贡献在于让人们理解了GFP发出荧光的机制。同时，他拓展出绿色之外的可用于标记的其他颜色，从而使科学家能够对各种蛋白和细胞施以不同的色彩。这一切，令在同一时间跟踪多个不同的生物学过程成为现实。钱永健1952年出生于美国纽约，1977年获得英国剑桥大学生理学博士学位，1989年起任美国加州大学圣地亚哥分校生物化学及化学系教授、美国国家科学院院士、国家医学院院士，2004年沃尔夫奖医学奖得主。钱永健的主要贡献在于利用水母发出绿光的化学物来追查实验室内

10、进行的生物反应，他被认为是这方面的公认先驱。RogerY.Tsien钱永健的贡献钱永健是取得重要成就的科学家。他在成像技术中，有两项重要工作都与下村修有一定关系。一项是钙染料。1980年钱永健发明检测钙离子浓度的染料分子，1981年改进将染料引入细胞的方法，以后发明更多、更好的染料，被广泛应用。检测钙的方法有三种：选择性电极、水母素、钙染料。在钱永健的钙染料没有出现以前，具有空间检测能力的只有水母素，但当时水母素需要注射到细胞内，应用不方便，而钱永健的染料可以通透到细胞里面去。水母素和钙染料各有优缺点，目前用染料的人多。钱永健还发明了多种染料用于研究其他分子。钱永健的第二项工作是GFP。199

11、4年起，钱永健开始研究GFP，改进GFP的发光强度，发光颜色（发明变种，多种不同颜色），发明更多应用方法，阐明发光原理。世界上应用的FP，多半是他发明的变种。他的专利有很多人用，有公司销售。钱永健的工作，从八十年代一开始就引人瞩目。他可能是世界上被邀请给学术报告最多的科学家，因为化学和生物界都爱听他的报告，既有技术应用、也有一些很有趣的现象。他1952年出生，年龄允许他等些年（而下村修没有这个优势）。所以，很多人多年认为钱永健会得诺贝尔奖，可以是化学、也可以是生理奖。值得指出，钱永健非常肯定下村修的工作，钱较早公开介绍下村修的发现。钱永健的贡献A guide to choosing fluor

12、escent proteins钱永健钱永健钱永健是钱学森的堂侄。他家多科学家和工程师。他中学时获得过西屋天才奖第一名，大学在哈佛念化学和物理，20岁毕业，后获英国剑桥大学生理学博士。他哥哥钱永佑（Richard W Tsien）是神经生物学家，曾任Stanford大学生理系主任。两兄弟分别获Rhodes和Marshall学者奖（通常认为是美国大学生竞争性最强的两个奖学金，克林顿总统曾获Rhodes），到英国留学，九十年代双双成为美国科学院院士。绿色荧光蛋白的优缺点绿色荧光蛋白的优缺点uGFP操作简单，不需要任何外加底物或辅酶因子，操作简单，不需要任何外加底物或辅酶因子，表达几乎不受种属的限制，

13、易于得到性质不同的表达几乎不受种属的限制，易于得到性质不同的突变体。特异性高、荧光稳定、无毒害。突变体。特异性高、荧光稳定、无毒害。uGFP体积较大（由体积较大（由238个氨基酸组成），它在活个氨基酸组成），它在活体标记中可能会影响被标记的蛋白质或细胞的正体标记中可能会影响被标记的蛋白质或细胞的正常生理功能。中等光稳定性限制了它在单分子研常生理功能。中等光稳定性限制了它在单分子研究中的应用。究中的应用。二二十十种种标标准准氨氨基基酸酸非定点标记非定点标记：通过目标蛋白上一些裸露的氨基、巯基或通过目标蛋白上一些裸露的氨基、巯基或羟基与一些带有活性反应基团的荧光试剂反应而实现。羟基与一些带有活性反

14、应基团的荧光试剂反应而实现。小分子蛋白荧光探针小分子蛋白荧光探针陈磊、姚祝军，生命科学，20，313（2008）.无法实现目标蛋白质特异性地定点标记，且无法保证被标记的蛋白保持其原有的活性。无法实现目标蛋白质特异性地定点标记，且无法保证被标记的蛋白保持其原有的活性。抗体的荧光标记抗体的荧光标记Fluorophores and their amine-reactive derivatives异硫氰酸类Althoughthethioureaproductisreasonablystable,ithasbeenreportedthatantibodyconjugatedwithfluorescent

15、isothiocyanatesdeteriorateovertime.琥珀酰亚胺酯SuccinimidylEstersareexcellentreagentsforaminemodificationbecausetheamidebondstheyformareasstableaspeptidebonds.蛋白的荧光标记蛋白的荧光标记Thiol reactive probesuThiol-reactive dyes are principally used to prepare fluorescent peptides,proteins and oligonucleotides for prob

16、ing biological structure,function and interactions.uBecause the thiol functional group is not very common in most proteins and can be labeled with high selectivity,thiol-reactive reagents often provide a means of modifying a protein at a defined site.特异性的小分子蛋白荧光探针特异性的小分子蛋白荧光探针u共价成键连接方式实现蛋白荧光标记共价成键连接

17、方式实现蛋白荧光标记正交有机化学反应正交有机化学反应 酶参与的细胞反应酶参与的细胞反应u非共价连接的蛋白荧光标记非共价连接的蛋白荧光标记陈磊、姚祝军，生命科学，20，313（2008）.特异性的小分子蛋白荧光探针特异性的小分子蛋白荧光探针陈磊、姚祝军，生命科学，20，313（2008）.配体接受体l两部分组成两部分组成：有机小分子：有机小分子荧光团荧光团和对目标蛋白具有特别专一性和对目标蛋白具有特别专一性识别作用的特定识别作用的特定配体配体或是或是化学官能团化学官能团。l原理原理：通过基因工程的手段对目标蛋白进行简洁的修饰，融入：通过基因工程的手段对目标蛋白进行简洁的修饰，融入一个能与荧光探针

18、上的配体或是官能团发生专一高效作用（成一个能与荧光探针上的配体或是官能团发生专一高效作用（成健相互作用或是非成健相互作用）的健相互作用或是非成健相互作用）的接受体接受体，通过两者的相通过两者的相互作用实现蛋白的定点荧光标记。互作用实现蛋白的定点荧光标记。正交有机化学反应在蛋白质正交有机化学反应在蛋白质荧光标记中的应用荧光标记中的应用u双砷染料四半胱氨酸标签体系uStaudinger-Bertozzi反应uHuisgen成环反应Click反应u天然化学链接反应uDiels-Alder反应陈磊、姚祝军，生命科学，20，313（2008）.双砷染料四半胱氨酸标签体系Science,1998,281,

19、269-272.As 双砷染料四半胱氨酸标签体系AdamsSR，TsienRY，Natureprotocols,3，1527-1533(2008).双砷染料-四半胱氨酸体系的优点lSmall size of the TC-Tag(6 amino acids,585 Da)is less likely to interfere with the structure or biological activity of the protein of interest.(蛋白质的N-端和C-端，内环或是a-螺旋的外表面）lFlAsH-EDT2 and ReAsH-EDT2 labeling reage

20、nts are membrane-permeable and readily cross the cell membrane,allowing labeling and detection of recombinant proteins in live mammalian cells.lFlAsH-EDT2 and ReAsH-EDT2 labeling reagents bind the TC-Tag with high specificity and high affinity(nM or lower KD),allowing targeted labeling of the protei

21、n of interest.双砷染料-四半胱氨酸体系的优点lFlAsH-EDT2 and ReAsH-EDT2 labeling reagents become strongly fluorescent(green and red,respectively)only upon binding the TC-Tag.They can be applied sequentially on the same sample,allowing temporal detection of protein turnover and trafficking.lReAsH-EDT2 labeling reage

22、nt can be used for both fluorescence-based microscopy and electron microscopy.lFlAsH-EDT2 labeling reagent provides a superior alternative to yellow-fluorescent protein(YFP)when coupled with cyan-fluorescent protein(CFP)for FRET-based cellular analysis.l The importance of pathogen detectionIdentific

23、ation and quantification of infectious disease agents are important for medical diagnosis,public health,food safety,environment monitoring,and anti-bioterrorism.Speed SensitivitySpecificityBacteriophage(噬菌体噬菌体):bacterias virus Integration of biarsenical-tetracysteine and phage for bacterial detectio

24、nLNWu,TTHuang,LLYang,JBPan,SBZhuandXMYan*,Angew.Chem.Int.Ed.Engl.2011,50,5873-5877.Bacterial detection with the TC-phage-FlAsH strategy using M13-TC LNWu,TTHuang,LLYang,JBPan,SBZhuandXMYan*,Angew.Chem.Int.Ed.Engl.2011,50,5873-5877.Bacterial detection with the TC-phage-FlAsH strategy using T7-TC LNWu

25、,TTHuang,LLYang,JBPan,SBZhuandXMYan*,Angew.Chem.Int.Ed.Engl.2011,50,5873-5877.LN Wu,XM Yan*,et al.Anal.Chem.,2014,86,907912.TraceDetectionofSpecificViableBacteriaUsingTetracysteine-TaggedBacteriophagesViabletargetcells 1:99 1:9,900 1:2,500,000 1:25,000,000 0 Viable target vs dead&viable but nontarge

26、t Detection limit:1 cell/mL 正交有机化学反应在蛋白质正交有机化学反应在蛋白质荧光标记中的应用荧光标记中的应用u双砷染料四半胱氨酸标签体系uStaudinger-Bertozzi反应uHuisgen成环反应Click反应u天然化学链接反应uDiels-Alder反应陈磊、姚祝军，生命科学，20，313（2008）.Staudinger-Bertozzi反应ClassicalStaudingerreaction化学专一、产率高、与水相容、细胞环境友好SaxonE,BertozziCR.Science,287,2007-2010(2000).ModifiedStaudin

27、gerreaction叠氮化物和膦生成氮叶立德叠氮化物和膦生成氮叶立德氮叶立德在水的存在下自发生成氮叶立德在水的存在下自发生成一个胺和一个膦氧化物一个胺和一个膦氧化物对反应给予一定的修饰，使之成对反应给予一定的修饰，使之成为一个酰胺键而不是产生胺。为一个酰胺键而不是产生胺。将Jurkat细胞放在含叠氮乙酰甘露糖胺的培养液中生长，叠氮基团可以通过唾液酸生物合成途径引入到细胞表面的糖蛋白上。此细胞和生物素化的膦作用，细胞上的叠氮基和膦反应生成一个稳定的肽键，从而形成一个非天然的生物素化的细胞表面，加入连有抗生物素的荧光探针，就实现了细胞表面的荧光标记。SaxonE,BertozziCR.Scien

28、ce,287,2007-2010(2000).lThedeliveryofazidestocellsurfacesthroughothercarbohydratebiosyntheticpathwayscouldsignificantlyexpandapplicationsofcellsurfaceengineering.lAzidesandphosphinesareabioticstructuresbothinsideandoutsidecells,whichraisestheexcitingpossibilitythattheirligationcouldproceedintheintra

29、cellularenvironment.lGivenexistingpowerfulmethodsforincorporatingunnaturalbuildingblocksintootherbiopolymers,oneneednotberestrictedtocellsurfaceoligosaccharidesashostsforthesechemicalhandles.Azidoaminoacids,forexample,couldbeintroducedintoproteinsandlatertargetedwithphosphineprobes.SaxonE,BertozziCR

30、.Science,287,2007-2010(2000).DistinguishedProfessorofChemistryProfessorofMolecularandCellBiologyatUCBerkeley.B.S.Chemistry,HarvardUniversity,1988Ph.D.Chemistry,UCBerkeley,1993PostdocCellularimmunology,UCSF,1993-1996Faculty,UCBerkeley,1996ElectedmemberoftheAmericanAcademyofArtsandSciences,2003Elected

31、memberoftheNationalAcademyofSciences,2005Prof.Bertozzisresearchinterestsspanthedisciplinesofchemistryandbiologywithanemphasisonstudiesofcellsurfaceglycosylationpertinenttodiseasestates.Herlabfocusesonprofilingchangesincellsurfaceglycosylationassociatedwithcancer,inflammationandbacterialinfection,and

32、exploitingthisinformationfordevelopmentofdiagnosticandtherapeuticapproaches.Inaddition,hergroupdevelopsnanoscience-basedtechnologiesforprobingcellfunctionandformedicaldiagnostics.Carolyn R.BertozziCarolyns father,William Bertozzi(MIT Physics),and her sister,Andrea Bertozzi(UCLA Mathematics).http:/ww

33、w.cchem.berkeley.edu/crbgrp/publications.htm2012正交有机化学反应在蛋白质正交有机化学反应在蛋白质荧光标记中的应用荧光标记中的应用u双砷染料四半胱氨酸标签体系uStaudinger-Bertozzi反应uHuisgen成环反应Click反应u天然化学链接反应uDiels-Alder反应陈磊、姚祝军，生命科学，20，313（2008）.Huisgen成环反应click反应在在Cu(I)的催化下，末端的催化下，末端炔和叠氮化物生成炔和叠氮化物生成1,2,3三唑。三唑。高选择性、水兼容性和高选择性、水兼容性和高产率高产率 点击化学点击化学Click ch

34、emistry，常译成“点击化学”，是2001年诺贝尔化学奖获得者美国化学家Sharpless提出的一种快速合成大量化合物的新方法，是继组合化学之后又一给传统有机合成化学带来重大革新的合成技术。目前，该技术已渗透到先导化合物库的建立、新药开发和聚合物的合成等领域。Dr.Barry SharplessThe Scripps Research InstituteH.C.Kolb,M.G.Finn,andK.B.Sharpless.Clickchemistry:diversechemicalfunctionfromafewgoodreactions.Angew.Chem.Int.Ed.Engl.40

35、:20042021(2001).Sharpless最广为人知的贡献是发现并命名三种转化过程，即不对称催化环氧化、二羟基化反应和不对称氨羟化反应。在2001年，夏普莱斯因此获得诺贝尔化学奖。2012:16262013:18781 canbemetabolicallyincorporatedintooutermembraneproteinC(OmpC)三唑基，三氮（杂）茂基正交有机化学反应在蛋白质正交有机化学反应在蛋白质荧光标记中的应用荧光标记中的应用u双砷染料四半胱氨酸标签体系uStaudinger-Bertozzi反应uHuisgen成环反应Click反应u天然化学链接反应uDiels-Ald

36、er反应陈磊、姚祝军，生命科学，20，313（2008）.Chem.Commun.2003,23,2870-1.将将含含有有半半胱胱氨氨酸酸氮氮端端的的目目标标蛋蛋白白在在活活细细胞胞中中表表达达，与与含含有有硫硫酯酯的的小小分分子子荧荧光光探探针针发发生生天天然然链链接接反反应应，从从而而得得到到所所需需的的荧荧光光标标记记蛋蛋白白。只只有有很很少少一一些些内内源源性性的的含含 N N-端端半半胱胱氨氨酸酸残残基基的的蛋蛋白白质质存存在在于于各各种种各各样样细细菌菌和和哺哺乳乳动动物物的的基基因因库库中中，使使得得基基于于天天然然链链接接反反应应的的标标记记方方法法可可在在不不同同的的 活活

37、 细细 胞胞 成成 像像 实实 验验 中中 得得 到到 应应 用用。正交有机化学反应在蛋白质正交有机化学反应在蛋白质荧光标记中的应用荧光标记中的应用u双砷染料四半胱氨酸标签体系uStaudinger-Bertozzi反应uHuisgen成环反应Click反应u天然化学链接反应uDiels-Alder反应陈磊、姚祝军，生命科学，20，313（2008）.Chem.Eur.J.2006,12,6095-6109.双烯加成，由共轭双烯与烯烃或炔烃反应生成六元环的反应 酶参与的细胞反应在蛋白质酶参与的细胞反应在蛋白质荧光标记中的应用荧光标记中的应用uAGT和受体组合荧光探针u脱卤酶和受体组合荧光探针u

38、PPtase和受体(PCP、ACP)组合荧光探针u生物素连接酶和受体组合荧光探针u转谷氨酰(TGase)和受体组合荧光探针u蛋白蛋白相互作用用于蛋白荧光标记陈磊、姚祝军，生命科学，20，313（2008）.NatBiotechnol,2003,21,86-89.AGT和受体组合荧光探针将将hAGT蛋白融合到目标蛋白上，然后利用蛋白融合到目标蛋白上，然后利用hAGT蛋白本身的活性将蛋白本身的活性将DNA上的氧上被烷基化的鸟磦呤的烷基转移到它本身的半胱氨酸的硫原子上，上的氧上被烷基化的鸟磦呤的烷基转移到它本身的半胱氨酸的硫原子上，在硫原子上进行细胞友好的烷基化反应，将标签分子连接到目标融合蛋在硫原

39、子上进行细胞友好的烷基化反应，将标签分子连接到目标融合蛋白上。白上。DNA烷基转移酶(AGT)人体人体DNA修复蛋白（修复蛋白（hAGT,25000 Da）Accounts Chem.Res.2011,44,666-676.Accounts Chem.Res.2011,44,730-741.Accounts Chem.Res.2011,44,730-741.Accounts Chem.Res.2011,44,784-792.Accounts Chem.Res.2011,44,816-827.非共价连接的蛋白荧光标记非共价连接的蛋白荧光标记u六组氨酸标签镍荧光团络合物体系uF36V型荧光探针u抗

40、体、生物素型荧光探针uDHFR型荧光探针u内蛋白介导的蛋白标记策略陈磊、姚祝军，生命科学，20，313（2008）.Cy3或或Cy5荧光团通过两个连接臂，并经由两个镍离子与六组氨酸标签通过强荧光团通过两个连接臂，并经由两个镍离子与六组氨酸标签通过强配位健络合，从而实现蛋白的定点标记。配位健络合，从而实现蛋白的定点标记。AliceTingatMITAliceTing,MIT1376-13811382-1387AliceTing,MIT1388-13931393-1398TsiensLab,UCSanDiego1399PeterG.Schultz,ScrippsResearchInstitute1

41、400PengCheng,北京大学NatureChemicalbiology(2011,2013)1401-14021402-14081409-1414The End.Tsien recently has set his sights on the imaging and treatment of cancer.uHeandhiscolleagueshavebuiltU-shapedpeptidemoleculestocarryapayloadanimagingmoleculeorchemotherapydrug.uThepeptidesaresubstratesforcertainprote

42、ases,protein-cleavingenzymesthatareexudedfromtumorcellsbutrarelyappearonnormalcells.WhentheproteasecleavesthebottomoftheU,thetwoarmsoftheUareseparated,unleashingonearmtodragthepayloadportionofthepeptideintoaneighboringcancercell.Ivealwayswantedtodosomethingclinicallyrelevantinmycareer,ifpossible,andcanceristheultimatechallenge,Tsiensays.