果胶裂解酶特性研究 课程论文.doc

1、摘 要 果胶裂解酶(pectin lyases，PNL，EC422.10)是果胶降解过程中的重要酶系，它通过一消旋的方式作用于半乳糖醛酸第5位的碳原子，使一碳原子上的H转移到了糖苷键的氧原子上，糖苷键断裂，在半乳糖醛酸的C4和C5之间形成双键，产生半乳糖醛酸寡聚糖。PNL是唯一通过反式消去作用降解高酯化程度果胶物质的果胶酶，而不需要果胶酯酶的酯化作用，在工业上具有广泛的应用，尤其在在果汁果酒的澄清与产汁和纺织造纸行业的麻料脱胶工艺。果胶裂解酶（Pectinlyase）为常用的食品用酶制剂，其来源主要是黑曲霉Aspergillus niger在严格控制的条件下进行液体深层发酵制备而成，且其性状为

2、棕色液体，产品颜色随批次不同略有不同。关键词：果胶裂解酶，OD值，活性，最适条件 第1章 绪 论1.1果胶裂解酶的用途 在果汁加工技术中，酶起着十分重要的作用。在苹果汁和浆果汁的生产中使用果胶酶和淀粉酶已经有60 多年的历史了。传统的果胶酶是将果胶结构完全降解，果胶裂解酶不必降解过多的细胞壁物质，通过一消旋的方式作用于半乳糖醛酸第5位的碳原子，使一碳原子上的H转移到了糖苷键的氧原子上，糖苷键断裂，在半乳糖醛酸的C4和C5之间形成双键，产生半乳糖醛酸寡聚糖，它将赋予更多的控制，是专一的反应。果胶裂解酶是果胶降解过程中的重要酶系，是唯一通过反式消去作用降解高酯化程度果胶物质的果胶酶，而不需要果胶酯

3、酶的酯化作用，在工业上具有广泛的应用，尤其在在果汁果酒的澄清与产汁和纺织造纸行业的麻料脱胶工艺。，1.2 果胶裂解酶基本性质研究的基本方法取20mL 05%果胶溶液于试管中, 40水浴平衡5min,加入05mL待测酶液, 40保温10min。取上述反应混合物05mL,加入45mL 005mol/L的HCl中,充分混合终止反应。相同条件下，在不加底物时，用盐酸对酶液进行灭活，设为对照，在235nm处测定吸光值,不饱和双键的摩尔吸光系数为5200。将每分钟分解果胶,使235nm处消光值增加10的酶量定义为1单位果胶裂解酶(PL)酶活。1.2.1不同浓度果胶裂解酶的活性的测定取20mL 05%果胶溶

4、液于试管中, 40水浴平衡5min,加入05mL不同浓度果胶裂解酶待测酶液, 40保温10min。向反应混合物中加入22.5mL 005mol/L的HCl中,充分混合终止反应，相同条件下，在不加底物时，用盐酸对酶液进行灭活，设为对照，在235nm处测定吸光值。1.2.2不同pH果胶裂解酶的活性的测定取20mL 05%不同pH的果胶溶液于试管中, 40水浴平衡5min,加入05mL果胶裂解酶待测酶液（1000倍稀释）, 40保温10min。向反应混合物中加入22.5mL 005mol/L的HCl中,充分混合终止反应，相同条件下，在不加底物时，用盐酸对酶液进行灭活，设为对照，在235nm处测定吸光

5、值。1.2.3不同保温时间果胶裂解酶的活性的测定取20mL 05%果胶溶液于试管中, 40、45、50等不同温度下水浴平衡5min,加入05mL不同浓度果胶裂解酶待测酶液（1000倍稀释）, 40、45、50等不同温度下保温10min。向反应混合物中加入22.5mL 005mol/L的HCl中,充分混合终止反应，相同条件下，在不加底物时，用盐酸对酶液进行灭活，设为对照，在235nm处测定吸光值。材料和方法2.1酶液实验室新进果胶裂解酶2.2 主要试剂及器材电子天平 上海精科隔水式电热恒温培养箱 上海跃进医疗器厂DL102 电热鼓风干燥箱 天津市实验仪器厂压力蒸汽灭菌器 上海博迅实业有限公司医疗

6、设备厂超净工作台 苏州净化设备股份公司UV-120-02紫外分光光度计 日本岛津 pH计 PB-10 赛多丽丝科学仪器有限公司蒸馏水 市售试管架、比色管、石英比色皿等 实验室自有设备2.3 溶液的配制 2.3.1 0.5%果胶溶液 0.2M,不同pH醋酸-醋酸钠缓冲液配制2.3.2 pH4.0 醋酸-醋酸钠缓冲液配制方法：甲液：0.2mol/L醋酸 6毫升冰醋酸用蒸馏水稀释到500毫升乙液：0.2mol/L 醋酸钠，1000mL蒸馏水中含27.22gNaAC.3H2O分别吸取 甲液82.0mL， 乙液18.0mL 2.3.3 pH4.4 醋酸-醋酸钠缓冲液配制方法：甲液：0.2mol/L醋酸

7、6毫升冰醋酸用蒸馏水稀释到500毫升乙液：0.2mol/L 醋酸钠，1000mL蒸馏水中含27.22gNaAC.3H2O分别吸取 甲液63.0mL， 乙液37.0mL 2.3.4 pH4.8 醋酸-醋酸钠缓冲液配制方法：甲液：0.2mol/L醋酸 6毫升冰醋酸用蒸馏水稀释到500毫升乙液：0.2mol/L 醋酸钠，1000mL蒸馏水中含27.22gNaAC.3H2O分别吸取 甲液41.0mL， 乙液59.0mL 2.3.5 pH5.2 醋酸-醋酸钠缓冲液配制方法：甲液：0.2mol/L醋酸 6毫升冰醋酸用蒸馏水稀释到500毫升乙液：0.2mol/L 醋酸钠，1000mL蒸馏水中含27.22gN

8、aAC.3H2O分别吸取 甲液21.0mL， 乙液79.0mL 注意：醋酸易挥发，有腐蚀性，应用保鲜膜密封，且应用pH计对缓冲液pH进行校对。2.4、实验方法2.4.1不同酶浓度影响的测定方法不同浓度酶液的稀释分别在50ml、100ml、200ml、500ml、1000ml容量瓶中取1mL的原酶液，定容，即为稀释后的酶液。 恒温分别吸取20mL 05% pH4.0的果胶溶液于25ml比色管中, 40水浴平衡5min,加入05mL不同浓度果胶裂解酶待测酶液, 40保温10min，做三组平行样。空白取一只比色管加入0.5mL稀释后的酶液加入22.5ml005mol/L的HCl充分摇匀后加入2mL果

9、胶溶液，与其它比色管一起水浴保温。定容分别向每支管中加005mol/L的HCl使其定容到25mL。盖上比色管管塞，混匀。测OD值在235nm下，以灭活管调零，用721型分光光度计测其他管管的果胶溶液的OD值。2.4.2不同pH的底物影响的测定方法取1000倍稀释的酶液在1000ml容量瓶中取1mL的原酶液，定容至1000ml，即为待测的酶液。 恒温分别吸取20mL 05% pH4.0 、pH4.4 、pH4.8、 pH5.2的果胶溶液于25ml比色管中, 40水浴平衡5min,加入05mL果胶裂解酶待测酶液, 40保温10min，做三组平行样。空白取一只比色管加入0.5mL稀释后的酶液加入22

10、.5ml005mol/L的HCl充分摇匀后加入2mL果胶溶液，与其它比色管一起水浴保温。定容分别向每支管中加005mol/L的HCl使其定容到25mL。盖上比色管管塞，混匀。测OD值在235nm下，以灭活管调零，用721型分光光度计测其他管管的果胶溶液的OD值。2.4.3不同保温时间影响的测定方法取1000倍稀释的酶液在1000ml容量瓶中取1mL的原酶液，定容至1000ml，即为待测的酶液。 恒温分别吸取20mL 05% pH4.0的果胶溶液于25ml比色管中, 40、45、50等不同温度下水浴平衡5min ,加入05mL果胶裂解酶待测酶液, 40、45、50等不同温度下保温10min，做三

11、组平行样。空白取一只比色管加入0.5mL稀释后的酶液加入22.5ml005mol/L的HCl充分摇匀后加入2mL果胶溶液，与其它比色管一起水浴保温。定容分别向每支管中加005mol/L的HCl使其定容到25mL。盖上比色管管塞，混匀。测OD值在235nm下，以灭活管调零，用721型分光光度计测其他管管的果胶溶液的OD值。2.4.4.酶活的测定：果胶裂解酶活力的测定：取2.0ml0.5%pH4.0的果胶溶液，放入25ml比色管中，将溶液在40oC条件下恒温水浴中加热5min，在加入0.5ml果胶裂解酶溶液混合，然后在40oC条件下恒温水浴中反应10min，反应后立即加入22.5ml005mol/

12、L的HCl，即定容至25mL，摇匀，充分终止酶反应，在235nm波长下测定吸光度值。 酶活计算公式：酶活力（U/mL）=(A235/b235)N25103 =48.077AN/b=48.077AN其中： A235为溶液的吸光光度值； b为比色皿厚度（cm）； 235为235nm下，不饱和半乳糖醛酸的摩尔吸光系数,即5200（cm-1M-1）； N为酶液的稀释倍数 酶活力单位： pH4.0，40oC每分钟水解果胶，使235nm处的消光值增加0.1的酶量定义为1单位果胶裂解酶（PL）酶活。 第3章 结果和讨论31不同酶浓度影响的测定方法取17支25mL的比色管，编号，分别按下表加入各种试剂：表4-

13、1不同酶浓度影响的测定方法稀释倍数组号HCl（ml）果胶裂解酶溶液（ml）0.5%果胶溶液（ml）OD值空白22.5000.5002.0000.00050倍稀释122.5000.5002.0000.357222.5000.5002.0000.353322.5000.5002.0000.348100倍稀释122.5000.5002.0000.337222.5000.5002.0000.332322.5000.5002.0000.329200倍稀释122.5000.5002.0000.321222.5000.5002.0000.326322.5000.5002.0000.329500倍稀释122.

14、5000.5002.0000.260222.5000.5002.0000.267322.5000.5002.0000.2631000倍稀释122.5000.5002.0000.274222.5000.5002.0000.275322.5000.5002.0000.272取20mL 05%果胶溶液于试管中, 40水浴平衡5min,加入05mL不同浓度果胶裂解酶待测酶液, 40保温10min。向反应混合物中加入22.5mL 005mol/L的HCl中,充分混合终止反应，相同条件下，在不加底物时，用盐酸对酶液进行灭活，设为对照，在235nm处测定吸光值,根据OD值，测定酶活力。稀释倍数OD值酶活力空

15、白0.000 0.000 50倍稀释0.357 858.174 0.353 848.559 0.348 836.540 100倍稀释0.337 1620.195 0.332 1596.156 0.329 1581.733 200倍稀释0.321 3086.543 0.326 3134.620 0.329 3163.467 500倍稀释0.260 6250.010 0.267 6418.279 0.263 6322.125 1000倍稀释0.274 13173.098 0.275 13221.175 0.272 13057.904 32不同pH果胶裂解酶的活性的测定取13支25mL的比色管，编号

16、，分别按下表加入各种试剂：表4-2不同pH果胶裂解酶的活性的测定pH组号HCl（ml）果胶裂解酶溶液（ml）0.5%果胶溶液（ml）OD值空白22.500 0.500 2.000 0.000 41 22.500 0.500 2.000 0.186 2 22.500 0.500 2.000 0.187 3 22.500 0.500 2.000 0.184 4.41 22.500 0.500 2.000 0.288 2 22.500 0.500 2.000 0.281 3 22.500 0.500 2.000 0.290 4.81 22.500 0.500 2.000 0.234 2 22.500

17、 0.500 2.000 0.230 3 22.500 0.500 2.000 0.260 5.21 22.500 0.500 2.000 0.340 2 22.500 0.500 2.000 0.350 3 22.500 0.500 2.000 0.334 取20mL 05%不同pH的果胶溶液于试管中, 40水浴平衡5min,加入05mL果胶裂解酶待测酶液（1000倍稀释）, 40保温10min。向反应混合物中加入22.5mL 005mol/L的HCl中,充分混合终止反应，相同条件下，在不加底物时，用盐酸对酶液进行灭活，设为对照，在235nm处测定吸光值，根据OD值，测定酶活力。pHOD值酶

18、活力空白0.000 0.000 40.186 8942.322 0.187 8990.399 0.184 8846.168 4.40.288 13846.176 0.281 13509.637 0.290 13942.330 4.80.234 11250.018 0.230 11057.710 0.260 12500.020 5.20.340 16346.180 0.350 16826.950 0.334 16057.718 33不同保温时间果胶裂解酶的活性的测定取13支25mL的比色管，编号，分别按下表加入各种试剂：表4-3不同保温时间果胶裂解酶的活性的测定温度组号HCl（ml）果胶裂解酶溶

19、液（ml）0.5%果胶溶液（ml）OD值空白22.500 0.500 2.000 0.000 401 22.500 0.500 2.000 0.1212 22.500 0.500 2.000 0.133 22.500 0.500 2.000 0.149451 22.500 0.500 2.000 0.1722 22.500 0.500 2.000 0.1723 22.500 0.500 2.000 0.188501 22.500 0.500 2.000 0.2552 22.500 0.500 2.000 0.2563 22.500 0.500 2.000 0.259551 22.500 0.5

20、00 2.000 0.2592 22.500 0.500 2.000 0.2653 22.500 0.500 2.000 0.281取20mL 05%果胶溶液于试管中, 40、45、50等不同温度下水浴平衡5min,加入05mL不同浓度果胶裂解酶待测酶液（1000倍稀释）, 40、45、50等不同温度下保温10min。向反应混合物中加入22.5mL 005mol/L的HCl中,充分混合终止反应，相同条件下，在不加底物时，用盐酸对酶液进行灭活，设为对照，在235nm处测定吸光值，根据OD值，测定酶活力。温度OD值酶活力空白0.000 0.000 400.121 5817.317 0.130 62

21、50.010 0.149 7163.473 450.172 8269.244 0.1728269.244 0.1889038.476 500.25512259.635 0.25612307.712 0.25912451.943 550.25912451.943 0.26512740.405 0.28113509.637 34结果讨论1果胶裂解酶的活性受多种因素影响，主要有pH，温度，酶浓度等几方面，经试验，当酶稀释到1000倍时，酶活力仍存在，且不断上升；其原因，可能是由于稀释酶与果胶底物接触充分，反映效果好。2.通过对比研究表明，果胶裂解酶在pH4.0是有平稳且较好的效果，随pH的增高，波动

22、加大。 3. 通过对温度的对比研究表明，酶在50时，有平稳且较高的活性，超过50，活性变化不大。 4.通过多次实验发现，酶液的保存条件，保存温度及保存时间对酶液活性具有负向影响；反应的预热时间及反应时间的长短对酶反应也有影响；所用灭活的HCl浓度对酶反应影响不大。 致谢本论文的实验过程和论文修正均是在田英华老师的悉心指导和直接参与下完成的。田老师的细心讲解，敏捷的思维，丰富的经验和对待学生认真负责的态度，都给我留下了深刻的印象，使我受益匪浅。在实验过程中我的动手操作能力和理论水平都有了很大程度的提高。衷心感谢田英华老师，在此致以诚挚的谢意！同时，感谢我的同学马华东和张佳丽的帮助与支持！ 参考文

23、献1 医学百科2 百度百科3 俞 中 果胶裂解酶_果蔬汁加工行业的一次新技术革命 （诺维信（中国）投资有限公司，北京100085）4 柯崇榕，杨欣伟，林晓华，吴毕莎，陈荣珠，黄建忠黑曲霉果胶裂解酶的生物信息分析（福建师范大学工业微生物教育部工程研究中心，福建省现代发酵技术工程研究中心，福建福州350108) 5 汤鸣强 黑曲霉产果胶酶的分离纯化和酶学特性研究（福建师范大学 2004） 6 赵政 董云舟 堵国成 陈坚 碱性果胶裂解酶摇瓶发酵条件的研究（ 工业微生物 - 2003, 33）7 王小敏 吴文龙 闾连飞 李维林 屈乐文 分光光度计法测定果胶酶活力的方法研究（江苏省中国科学院植物研究院 210014） 8 李忠福 徐建国 分光光度法测定果胶酶活性方法的研究（ 哈尔滨制药总厂 150086）9丁凤平 张秀芝 碱性果胶酶PATE及其测定方法（ 南京生物化学制药研究所 ）课程论文用纸13